The Dynamic Structural Effects of Activating ERBB Kinase Somatic Mutations

Abstract

The ERBB family of receptor tyrosine kinases, epidermal growth factor receptor (EGFR, ERBB1), ERBB2, ERBB3 and ERBB4, are transmembrane signaling proteins that regulate cellular processes such as cell survival, mobility, proliferation and differentiation. Normal activity of the ERBBs is essential for tissue growth and organ development. An array of somatic mutations of the ERBB genes have been linked to human malignancies. As a result, the ERBBs are important treatment targets, with multiple ERBB-based drugs currently in effective clinical use against e.g. lung, breast and colorectal cancers.

A comprehensive characterization of the ERBB somatic mutations identified in cancer samples is essential to unveil the molecular level impacts of the genetic alterations that could play a role in tumorigenesis. In this thesis, the structural consequences of four cancer-associated ERBB kinase mutations that aberrantly activate EGFR and ERBB2 proteins were explored. The mutations include three EGFR alterations, 746ΔELREA750 (ΔELREA), V769insASV and D770insNPG, and an ERBB2 missense mutation: E936K. The ERBB receptors and proteins in general are dynamic molecules. Hence, the possible structural changes exerted by the above activating mutations were examined by employing molecular dynamics simulations, which allow the assessment of time-dependent structural motions.

The simulations revealed that the EGFR ΔELREA deletion mutation stabilizes the active state EGFR conformation by conserving the states of key structural units, such as the αC helix and the Lys745 Glu762 salt bridge, which were disrupted in the wild-type EGFR. Furthermore, the deletion resulted in a structural change on the inactive EGFR state, an inward movement of the αC helix, which could drive a conformational change from the inactive towards the active EGFR state. The V769insASV and D770insNPG EGFR insertion mutations also led to the better stability of the active EGFR conformation relative to the wild-type EGFR. Moreover, the insertions obstructed the formation of an autoinhibitory interaction between Ala767 and Arg776 in the inactive EGFR conformation, which would predispose EGFR to transition to the catalytically active EGFR state. The ERBB2 E936K mutation affected the nature of interactions taking place at the ERBB2 homodimer and heterodimer interface, with a new inter-monomer ionic interaction being formed that strengthened the monomer-monomer binding. Consequently, the duration of the activated ERBB2 dimer would be extended, which fuels the phosphorylation of ERBB2.

Taken together, this thesis demonstrated that a series of structural changes are at play that collectively elicit the experimentally reported functional changes by these activating ERBB mutations. A thorough examination of the mutation-induced structural alterations furthers our knowledge on the role the mutations play in cancer progression and the results are essential knowledge when using structure-based, rational design of ligands that could inhibit ERBB kinase activity and subsequent receptor signaling. Such ligands have potential for further development towards a therapeutic agent in efforts to tackle cancers.

----------

ERBB-familjen av tyrosinkinasreceptorer, epidermala tillväxtfaktorreceptorer (EGFR, ERBB1), ERBB2, ERBB3 och ERBB4 är transmembrana signalproteiner som reglerar cellulära processer så som överlevnad, mobilitet, proliferation och differentiering. Normal aktivitet hos ERBB är nödvändigt för vävnadstillväxt och organutveckling. En mängd somatiska mutationer i ERBB generna har kopplats till cancer. På grund av detta är ERBB-proteinerna viktiga mål för behandling och flera ERBB-baserade läkemedel är för tillfället i klinisk användning, t.ex. vid lung-, bröst- och kolorektalcancer.

En omfattande karakterisering av de somatiska mutationerna i ERBB, som identifierats i cancerprover, är nödvändig för att påvisa vilken effekt de genetiska förändringarna på en molekylärnivå kan ha för tumörutveckling. I den här avhandlingen utforskades de strukturella konsekvenserna av fyra cancer-associerade ERBB kinas-mutationer som felaktigt aktiverar EGFR och ERBB2 proteiner. Mutationerna inkluderar tre EGFR förändringar, 746ΔELREA750 (ΔELREA), V769insASV och D770insNPG, och en ERBB2 missense-mutation: E936K. ERBB receptorer och proteiner är dynamiska molekyler och därför användes molekyldynamiska simulationer för att studera de möjliga strukturella förändringar som de ovan nämnda aktiverande mutationerna orsakar, vilket ger möjlighet att utvärdera tidsberoende strukturella rörelser.

Simulationerna visade att EGFR ΔELREA deletion-mutationen stabiliserar det aktiva stadies konformation i EGFR genom att bevara stadierna för viktiga strukturella enheter, så som helix αC och saltbryggan mellan Lys745 och Glu762, som båda avbryts i wild-type EGFR. Deletionmutationen resulterade dessutom i en strukturell förändring i det inaktiva EGFR stadiet, en inåtgående rörelse i helix αC som kunde orsaka en konformationsförändring från det inaktiva till det aktiva stadiet i EGFR. V769insASV och D770insNPG EGFR insertion-mutationerna ledde också till bättre stabilitet för den aktiva konfirmationen i EGFR i förhållande till wild-type EGFR. Insertion-mutationerna hindrade också bildningen av en autoinhiberande interaktion mellan Ala767 och Arg776 i den inaktiva konformationen för EGFR, vilket skulle göra det mera troligt att EGFR övergår till det katalytiskt aktiva stadiet. E936K-mutationen i ERBB2 påverkade typen av interaktioner som sker vid ERBB2:s homodimera- och heterodimera gränsytor, där en ny jonisk interaktion formas mellan monomererna och stärkte monomer-monomer bindningen. Följaktligen förlängs varaktigheten hos den aktiverade ERBB2-dimeren, vilket ökar fosforyleringen av ERBB2.

Sammanfattningsvis visar den här avhandlingen att en serie av strukturella förändringar spelar en roll i att kollektivt orsaka de experimentellt rapporterade funktionella förändringarna genom de vi aktiverande ERBB-mutationerna. En grundlig genomgång av de mutationsinducerade förändringarna ökar vår kunskap om vilken roll mutationer spelar i cancerprogression, och resultaten är nödvändig kunskap när man använder sig av strukturbaserad, rationell design av ligander som kunde inhibera ERBB kinas-aktiviteten och påföljande receptorsignalering. Dylika ligander kan potentiellt vidareutvecklas till en ny behandlingsmetod för cancer.