Molecular Basis of the Sticholysin-Membrane Interaction : On the Structure of the Pore and the Effects of Lipids
Palacios Ortega, Juan (2021-06-18)
Åbo Akademi University
Universidad Complutense de Madrid
18.06.2021
Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:ISBN:978-952-12-4074-4
https://urn.fi/URN:ISBN:978-952-12-4074-4
Tiivistelmä
The usefulness of toxicity across the tree of life is far beyond doubt. Most, if not all, organisms produce compounds that can be used for attack and/or defense against external entities. Some of the most specialized of these compounds are toxic proteins, among which pore-forming toxins (PFTs) particularly excel. PFTs are present in all kingdoms of life. Given the wide variety of PFTs, one can expect a multitude of different specificities and mechanisms of action, of which we will certainly take advantage at some point. For that, a thorough characterization of PFTs and their functionality is necessary. In this thesis, we have taken further the characterization of sticholysins, small PFTs produced by the sea anemone Stichodactyla helianthus.
In paper I, the influence of bilayer thickness on the pore forming activity of sticholysins has been studied. Model lipid bilayers made mainly of a phosphatidylcholine (PC), with two monounsaturated acyl chains that determined membrane thickness, were used. Myristoyl-sphingomyelin (14:0-SM) was included to ensure membrane recognition by sticholysins. The effect of cholesterol (Chol) was also evaluated. The preferred thickness for sticholysins was that of di-18:1-PC membranes. This seems to be a result of evolutionary pressure since it agrees with the most common acyl chains found in analyzed fish.
In paper II, different fluorescent derivatized lipids, Sticholysin II (StnII) tryptophan mutants, and oleoyl-ceramide (OCer) were used to delve into the relationship between StnII and Chol and sphingomyelin (SM). We found that Chol favored SM recognition by StnII while, concomitantly, StnII rearranged the membrane, extracting Chol from the SM-rich domains. In fact, Chol was preferentially distributed near StnII.
In paper III, we evaluated the mechanism of the release of aqueous contents from vesicles. Several different probes were employed. We found that the StnII pore is too small for calcein to leak through. We propose that molecules of comparable size to calcein are released through the membrane perturbations produced by StnII during pore formation. The final pore would only let through very small molecules, such as dithionite.
In paper IV, a single-cysteine mutant of StnI was used to study oligomerization directly in unrestrained environments, such as that of model membranes. The results are consistent with previous structures obtained for other actinoporins. Furthermore, we have observed that the stoichiometry of the complex was maintained when StnII was included in the complex. The results in solution also support the previously observed ability of StnII to promote StnI binding to membranes.
----------
Nyttan av toxicitet hos olika organismer är långt bortom tvivel. De flesta, om inte alla, organismer producerar föreningar som kan användas för attack och/eller försvar mot externa hot. Några av de mest specialiserade av dessa föreningar är toxiska proteiner, bland vilka por-bildande toxiner (eng., pore-forming toxins, PFT) är särskilt utmärkande. PFT finns i alla livets riken. Med tanke på det stora utbudet av PFT kan man förvänta sig en mängd olika specificiteter och verkningsmekanismer, som vi kan komma att dra nytta i olika tillämpningar. Därför är en grundlig karakterisering av PFT-peptider och deras funktionalitet nödvändig. I denna avhandling har vi undersökt och karakteriser olika stickolysiner, vilka är små PFT-peptider producerade av havsanemonen Stichodactyla helianthus.
I arbete I har påverkan av membraners dubbelskiktstjocklek på den porbildande aktiviteten hos stikolysiner studerats. Modellmembraner tillverkade huvudsakligen av en fosfatidylkolin (PC), med två enkelomättade acylkedjor. Genom att variera acylkedjans längd kunde de bildade bilagrens tjocklek påverkas. Myristoylsfingomyelin (14:0-SM) inkluderades för att säkerställa membranigenkänning hos stickolysinerna. Effekten av kolesterol (eng., cholesterol, Chol) utvärderades också eftersom det också påverkar bilagertjockleken. Den mest optimala membrantjockleken för stickolysiner var den tillverkad av di-18: 1-PC. Detta verkar vara ett resultat av evolutionärt tryck eftersom det överensstämmer med de vanligaste acylkedjorna som finns i membraner hos tex fisk.
I arbete II användes olika fluorescerande lipider, tryptofanmutanter av sticholysin II (StnII) och oleoyl-ceramid (OCer) för att studera samverkan mellan StnII och membrane innehållande Chol och sfingomyelin (SM). Vi fann att Chol gynnade SMigenkänning av StnII medan StnII samtidigt ordnade upp membranet och drog ut Chol från de SM-rika domänerna. I själva verket distribuerades Chol företrädesvis nära StnII.
I arbete III utvärderade vi mekanismen för frisättning av vattenlösliga småmolekylära föreningar från membranvesikler. Flera olika sonder användes vid studierna. Vi fann att StnII-poren är för liten för att kalcein skall läcka igenom. Eftersom kalcein ändå frigörs från vesikler när de exponeras för stickolysiner, antar vi att andra orsaker än porer förorsakar ökad membranpermeabilitet i närvaro av stickolysiner. Den slutliga poren kan bara släppa igenom mycket små molekyler, såsom ditionit.
I arbete IV användes en cysteinmutant av StnI för att studera oligomerisering direkt i lösning eller i bilagermembraner. Resultaten som erhölls överensstämmer med tidigare visade strukturer för andra aktinoporiner. Vidare har vi observerat att porkomplexets stökiometri bibehölls när StnII inkluderades med StnI i komplexet. Resultaten med Stn i lösning stöder den tidigare observerade förmågan hos StnII att främja Stnl-bindning till membran. ------------
La toxicidad es indudablemente útil para los seres vivos. La mayoría, si no todos los organismos, producen compuestos para usarlos contra otros seres vivos, ya sea con fines de defensa o de ataque. Algunos de los más especializados de estos compuestos son las proteínas tóxicas, entre las que destacan las toxinas formadoras de poros (ing., pore-forming toxins, PFT). Estas proteínas pueden encontrarse en todos los reinos de la vida. Dada su amplia diversidad, puede esperarse que tengan una gran variedad de especificidades y mecanismos de acción. Una caracterización detallada de las PFT y su funcionalidad es un requisito fundamental para, en un futuro, poder beneficiarse de la acción de estas toxinas. Por ello, en esta tesis se ha profundizado en el comportamiento de las esticolisinas, pequeñas PFT producidas por la anémona del mar Caribe Stichodactyla helianthus.
En el artículo I, se estudió la influencia del grosor de membrana en la actividad de formación de poros de las esticolisinas. Para ello, se utilizaron bicapas lipídicas hechas principalmente de fosfatidilcolina (PC) con cadenas de acilo monoinsaturadas, cuya longitud determinaba el grosor de la membrana. La miristoil-esfingomielina (14:0-SM) fue incluida para asegurar la unión a la membrana de las esticolisinas. Se evaluó también el efecto del colesterol (ing., cholesterol, Chol). El grosor preferido resultó ser el de las membranas que incluían di-18:1-PC. Esta preferencia parece ser resultado de la presión evolutiva, ya que coincide con la longitud de las cadenas de acilo más comunes en los peces analizados.
En el artículo II, se profundizó en la relación entre la esticolisina II (StnII), el Chol y la esfingomielina (SM). Para ello, se utilizaron diferentes lípidos fluorescentes, mutantes de triptófano de la esticolisina II (StnII) y oleoil-ceramida (OCer). Los resultados obtenidos sugieren que el Chol favorece el reconocimiento de la SM por parte de StnII mientras que, simultáneamente, StnII remodela la membrana, extrayendo el Chol de los dominios ricos en SM. De hecho, una vez alcanzado el equilibrio, el Chol resulta estar distribuido preferentemente cerca de StnII.
En el artículo III, se evaluó el mecanismo de liberación de contenidos acuosos de vesículas modelo, empleando diferentes sondas fluorescentes. De acuerdo con las observaciones, el poro de StnII es demasiado pequeño para que la calceína pueda pasar a través de él. Se propone, por tanto, que la liberación de moléculas de tamaño comparable al de la calceína se produce a través de perturbaciones en la membrana inducidas por StnII durante la formación del poro. El poro final sólo dejaría pasar moléculas de menor tamaño, como puede ser la molécula de ditionito.
En el artículo IV, se utilizó un mutante puntual de cisteína de StnI para estudiar la oligomerización de las esticolisinas directamente en un ambiente sin restricciones, como es el de la superficie de las membranas modelo. Los resultados obtenidos son coherentes con las estructuras anteriores obtenidas para otras actinoporinas. Además, hemos observado que la estequiometria del complejo se mantiene cuando al mezclar ambas esticolisinas. Los resultados obtenidos en ausencia de membranas refuerzan las
observaciones previas que sugerían que StnII es capaz de facilitar la actividad de StnI, presumiblemente porque estaría favoreciendo su unión a la membrana.
In paper I, the influence of bilayer thickness on the pore forming activity of sticholysins has been studied. Model lipid bilayers made mainly of a phosphatidylcholine (PC), with two monounsaturated acyl chains that determined membrane thickness, were used. Myristoyl-sphingomyelin (14:0-SM) was included to ensure membrane recognition by sticholysins. The effect of cholesterol (Chol) was also evaluated. The preferred thickness for sticholysins was that of di-18:1-PC membranes. This seems to be a result of evolutionary pressure since it agrees with the most common acyl chains found in analyzed fish.
In paper II, different fluorescent derivatized lipids, Sticholysin II (StnII) tryptophan mutants, and oleoyl-ceramide (OCer) were used to delve into the relationship between StnII and Chol and sphingomyelin (SM). We found that Chol favored SM recognition by StnII while, concomitantly, StnII rearranged the membrane, extracting Chol from the SM-rich domains. In fact, Chol was preferentially distributed near StnII.
In paper III, we evaluated the mechanism of the release of aqueous contents from vesicles. Several different probes were employed. We found that the StnII pore is too small for calcein to leak through. We propose that molecules of comparable size to calcein are released through the membrane perturbations produced by StnII during pore formation. The final pore would only let through very small molecules, such as dithionite.
In paper IV, a single-cysteine mutant of StnI was used to study oligomerization directly in unrestrained environments, such as that of model membranes. The results are consistent with previous structures obtained for other actinoporins. Furthermore, we have observed that the stoichiometry of the complex was maintained when StnII was included in the complex. The results in solution also support the previously observed ability of StnII to promote StnI binding to membranes.
----------
Nyttan av toxicitet hos olika organismer är långt bortom tvivel. De flesta, om inte alla, organismer producerar föreningar som kan användas för attack och/eller försvar mot externa hot. Några av de mest specialiserade av dessa föreningar är toxiska proteiner, bland vilka por-bildande toxiner (eng., pore-forming toxins, PFT) är särskilt utmärkande. PFT finns i alla livets riken. Med tanke på det stora utbudet av PFT kan man förvänta sig en mängd olika specificiteter och verkningsmekanismer, som vi kan komma att dra nytta i olika tillämpningar. Därför är en grundlig karakterisering av PFT-peptider och deras funktionalitet nödvändig. I denna avhandling har vi undersökt och karakteriser olika stickolysiner, vilka är små PFT-peptider producerade av havsanemonen Stichodactyla helianthus.
I arbete I har påverkan av membraners dubbelskiktstjocklek på den porbildande aktiviteten hos stikolysiner studerats. Modellmembraner tillverkade huvudsakligen av en fosfatidylkolin (PC), med två enkelomättade acylkedjor. Genom att variera acylkedjans längd kunde de bildade bilagrens tjocklek påverkas. Myristoylsfingomyelin (14:0-SM) inkluderades för att säkerställa membranigenkänning hos stickolysinerna. Effekten av kolesterol (eng., cholesterol, Chol) utvärderades också eftersom det också påverkar bilagertjockleken. Den mest optimala membrantjockleken för stickolysiner var den tillverkad av di-18: 1-PC. Detta verkar vara ett resultat av evolutionärt tryck eftersom det överensstämmer med de vanligaste acylkedjorna som finns i membraner hos tex fisk.
I arbete II användes olika fluorescerande lipider, tryptofanmutanter av sticholysin II (StnII) och oleoyl-ceramid (OCer) för att studera samverkan mellan StnII och membrane innehållande Chol och sfingomyelin (SM). Vi fann att Chol gynnade SMigenkänning av StnII medan StnII samtidigt ordnade upp membranet och drog ut Chol från de SM-rika domänerna. I själva verket distribuerades Chol företrädesvis nära StnII.
I arbete III utvärderade vi mekanismen för frisättning av vattenlösliga småmolekylära föreningar från membranvesikler. Flera olika sonder användes vid studierna. Vi fann att StnII-poren är för liten för att kalcein skall läcka igenom. Eftersom kalcein ändå frigörs från vesikler när de exponeras för stickolysiner, antar vi att andra orsaker än porer förorsakar ökad membranpermeabilitet i närvaro av stickolysiner. Den slutliga poren kan bara släppa igenom mycket små molekyler, såsom ditionit.
I arbete IV användes en cysteinmutant av StnI för att studera oligomerisering direkt i lösning eller i bilagermembraner. Resultaten som erhölls överensstämmer med tidigare visade strukturer för andra aktinoporiner. Vidare har vi observerat att porkomplexets stökiometri bibehölls när StnII inkluderades med StnI i komplexet. Resultaten med Stn i lösning stöder den tidigare observerade förmågan hos StnII att främja Stnl-bindning till membran.
La toxicidad es indudablemente útil para los seres vivos. La mayoría, si no todos los organismos, producen compuestos para usarlos contra otros seres vivos, ya sea con fines de defensa o de ataque. Algunos de los más especializados de estos compuestos son las proteínas tóxicas, entre las que destacan las toxinas formadoras de poros (ing., pore-forming toxins, PFT). Estas proteínas pueden encontrarse en todos los reinos de la vida. Dada su amplia diversidad, puede esperarse que tengan una gran variedad de especificidades y mecanismos de acción. Una caracterización detallada de las PFT y su funcionalidad es un requisito fundamental para, en un futuro, poder beneficiarse de la acción de estas toxinas. Por ello, en esta tesis se ha profundizado en el comportamiento de las esticolisinas, pequeñas PFT producidas por la anémona del mar Caribe Stichodactyla helianthus.
En el artículo I, se estudió la influencia del grosor de membrana en la actividad de formación de poros de las esticolisinas. Para ello, se utilizaron bicapas lipídicas hechas principalmente de fosfatidilcolina (PC) con cadenas de acilo monoinsaturadas, cuya longitud determinaba el grosor de la membrana. La miristoil-esfingomielina (14:0-SM) fue incluida para asegurar la unión a la membrana de las esticolisinas. Se evaluó también el efecto del colesterol (ing., cholesterol, Chol). El grosor preferido resultó ser el de las membranas que incluían di-18:1-PC. Esta preferencia parece ser resultado de la presión evolutiva, ya que coincide con la longitud de las cadenas de acilo más comunes en los peces analizados.
En el artículo II, se profundizó en la relación entre la esticolisina II (StnII), el Chol y la esfingomielina (SM). Para ello, se utilizaron diferentes lípidos fluorescentes, mutantes de triptófano de la esticolisina II (StnII) y oleoil-ceramida (OCer). Los resultados obtenidos sugieren que el Chol favorece el reconocimiento de la SM por parte de StnII mientras que, simultáneamente, StnII remodela la membrana, extrayendo el Chol de los dominios ricos en SM. De hecho, una vez alcanzado el equilibrio, el Chol resulta estar distribuido preferentemente cerca de StnII.
En el artículo III, se evaluó el mecanismo de liberación de contenidos acuosos de vesículas modelo, empleando diferentes sondas fluorescentes. De acuerdo con las observaciones, el poro de StnII es demasiado pequeño para que la calceína pueda pasar a través de él. Se propone, por tanto, que la liberación de moléculas de tamaño comparable al de la calceína se produce a través de perturbaciones en la membrana inducidas por StnII durante la formación del poro. El poro final sólo dejaría pasar moléculas de menor tamaño, como puede ser la molécula de ditionito.
En el artículo IV, se utilizó un mutante puntual de cisteína de StnI para estudiar la oligomerización de las esticolisinas directamente en un ambiente sin restricciones, como es el de la superficie de las membranas modelo. Los resultados obtenidos son coherentes con las estructuras anteriores obtenidas para otras actinoporinas. Además, hemos observado que la estequiometria del complejo se mantiene cuando al mezclar ambas esticolisinas. Los resultados obtenidos en ausencia de membranas refuerzan las
observaciones previas que sugerían que StnII es capaz de facilitar la actividad de StnI, presumiblemente porque estaría favoreciendo su unión a la membrana.