Development of Novel Drugs Targeting Chaperones of Oncogenic K-Ras

Abstract

KRAS mutations account globally for about one million deaths per year, but there is as yet no approved drug against KRAS. K-Ras proteins are organized into di-/oligomeric nanoscale signaling complexes, known as nanoclusters on the plasma membrane. In this thesis, I describe two targeting approaches to indirectly inhibit the oncogenic activity of K-Ras. First, we designed inhibitors that block the interaction between the trafficking chaperone PDE6D and K-Ras, thus blocking membrane localization of K-Ras. Secondly, we showed how the major folding chaperone Hsp90 and its co-chaperone Cdc37 affect K-Ras signaling. We then went on to develop and test novel inhibitors against the interface between Hsp90 and Cdc37.

K-Ras requires several post-translational modifications, such as farnesylation, for proper organization on the plasma membrane. Interaction of farnesylated KRas with the trafficking chaperone PDE6D results in its effective solubilization and translocation in the cytosol. Available PDE6D inhibitors are easily dislodged from PDE6D through the GTP-ARL2 unloading mechanism, consequently limiting the overall cellular potency of these inhibitors. To address this problem, we improved the compound design to withstand the ejection mechanism and added a cell penetration group to increase the bioavailability.

The second part connects to our previous finding, showing that the inhibition of Hsp90/Cdc37 by conglobatin A selectively blocks the activity of K-Ras but not H-Ras, and inhibits stemness activity of cancer cells. However, the exact mechanism by which Hsp90/Cdc37 inhibition blocks the activity of K-Ras remained unclear. Here, we discovered that the inhibition of Hsp90 downregulates the K-Ras nanocluster modulator galectin-3 by inhibiting HIF-1α. Decreased expression levels of galectin-3 and Hsp90-clients B- and C-Raf jointly contributed to selectively disrupt K-Ras membrane nanoclusters, thus blocking the oncogenic activity of K-Ras.

In order to identify novel Hsp90/Cdc37 inhibitors, we first selected compounds from a computational screening and then validated their ability to interrupt the Hsp90/Cdc37 complex in a split Renilla luciferase assay. Finally, we discovered two compounds that inhibited the Hsp90/Cdc37 complex formation. By assessing these compounds in cellular assays, we confirmed their K-Ras membrane organization disrupting activity and the impairment of the signaling pathways downstream of K-Ras. Furthermore, these compounds also decreased K-Ras dependent cancer cell proliferation in 2D monolayers, 3D spheroid growth and microtumor formation. Taken together, the work of this thesis has led to the development and characterization of novel small molecule inhibitors that indirectly target K-Ras. Our findings may form the basis for the development of future therapeutic agents against K-Ras dependent human diseases.

---------- KRAS-mutationer står globalt för cirka en miljon dödsfall per år, men det finns ännu inget godkänt läkemedel mot KRAS. K-Ras-proteiner är organiserade i di- /oligomera signalkomplex i nanoskala, kända som nanokluster på plasmamembranet. I denna avhandling beskriver jag två olika metoder för att indirekt hämma den onkogena aktiviteten hos K-Ras. Först designade vi hämmare som blockerar interaktionen mellan den intracellulära transport chaperonen PDE6D och K-Ras, för att blockera membranlokalisering av K-Ras. Som andra visade vi hur den huvudsakliga proteinvecknings chaperonen Hsp90 och dess co-chaperon Cdc37 påverkar K-Ras-signalering. Vi fortsatte sedan med att utveckla och testa nya hämmare mot samspelmellan Hsp90 och Cdc37.

För korrekt organisering på plasmamembranen kräver K-Ras flera posttranslationell modifieringar, såsom farnesylering. Interaktionen mellan den farnesylerade K-Ras och chaperonen PDE6D resulterar i effektiv nedbrytning av K-Ras och dess translokering i cytosolen. Tillgängliga PDE6D-hämmare lösgörs lätt från PDE6D genom en GTP-ARL2- avstötningsmekanism. Detta har till följd att den totala cellulära effekten hos dessa hämmare begränsas. För att lösa detta problem förbättrade vi föreningens (hämmarens) design, så att den bättre kan motstå avstötningsmekanismen. Dessutom ökade vi dess biologiska tillgänglighet genom att lägga till en kemisk grupp, som ökar hämmarens förmåga att penetrera cellmembranen.

Den andra delen ansluter till våra tidigare forskningsresultat som visar att blockering av Hsp90/Ccd37 med conglobatin A blockerar selektivt K-Ras aktivitet utan att påverka H-Ras aktivitet, samtidigt som den inhiberar stamcellsförmågan i cancerceller. Den exakta mekanismen genom vilken Hsp90 / Cdc37-inhibering blockerar K-Ras aktivitet förblev emellertid oklar. I denna avhandling upptäckte vi att hämningen av Hsp90 nedreglerar galectin-3, en nanoklustermodulator för K-Ras, genom att hämma HIF-lα. Minskade expressionsnivåer av galectin-3 och Hsp90-klienterna B- och C-Raf bidrog gemensamt till att selektivt hindra K-Ras från att bilda membran-nanokluster, som i sin tur ledde till att den onkogena aktiviteten hos K-Ras blockerades.

För att identifiera nya Hsp90 / Cdc37-hämmare valde vi först ut föreningar genom datorscreening och validerade sedan deras förmåga att avbryta Hsp90 /Cdc37-komplexet med hälp av ett delat Renilla-luciferastest. Vi upptäckte slutligen två föreningar som hämmade komplexbildningen av Hsp90 / Cdc37. Genom att utvärdera dessa föreningar i cellulära analyser, bekräftade vi deras förmåga att hindra K-Ras-membranorganisation och försämring av signalvägarna nedströms från K-Ras. Dessa föreningar minskade dessutom också K-Rasberoende tillväxt av cancerceller i 2D-monolager, 3D-sfäroid tillväxt och mikrotumörbildning. Sammantaget har arbetet i denna avhandling lett till utveckling och karakterisering av nya småmolekylära hämmare som indirekt riktar sig mot K-Ras. Våra resultat kan ligga till grund för utvecklingen av framtida terapeutiska medel mot K-Ras-beroende sjukdomar.