Use of molecular methods in biothreat preparedness
Koskela, Katja (2017-05-05)
Koskela, Katja
Helsingin yliopisto
Muu
Tohtoriopiskelijan väitöskirja
National Defence University
05.05.2017
Julkinen
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:ISBN:978-951-25-2903-2
https://urn.fi/URN:ISBN:978-951-25-2903-2
Tiivistelmä
Mikrobin tai biologisen materiaalin aiheuttamaa epidemiaa tai sen uhkaa kutsutaan biologiseksi uhkaksi, silloin kun tauti ei tartuntavaaransa vuoksi ole yhteiskunnan normaaliresurssein hoidettavissa tai kun kyseessä on laaja epidemia, jonka hallitsemiseen tavanomaiset resurssit eivät riitä. Biologinen uhka voi olla luonnollinen, kuten esimerkiksi Länsi-Afrikan laaja ebolaepidemia vuosina 2014–2016, tai tahallinen mikrobin tai toksiinin levittäminen.
Väitöskirjan tavoitteena oli kehittää ja hyödyntää molekyylibiologisia menetelmiä biologisten uhka-agenssien nopeaa ja luotettavaa tunnistamista varten. Työn tarkoituksena oli tunnistaa ja tyypittää biologisia uhka-agensseja, olivat ne sitten luonnollisia ja tahallisesti levitettyjä. Työssä hyödynnettiin polymeraasiketjureaktiota (PCR) bakteerien tunnistamisessa sekä tautia aiheuttavien ja vaarattomien bakteerikantojen erottelussa toisistaan. Lisäksi käytettiin hyväksi 16S ribomaalisen RNA (rRNA) - geenin sekvensointia tutkittaessa polymikrobisia näytteitä, ja Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) -geenialueiden vertailua bakteerien tyypityksessä.
Kolera, Vibrio cholerae -bakteerin aiheuttama tauti, on maailmanlaajuisesti suuri kansanterveydellinen ongelma. Lisäksi Yhdysvaltain tartuntatautivirasto CDC (Centers for Disease Control and Prevention) on luokitellut V. cholerae -bakteerin yhdeksi potentiaaliseksi biouhka-agenssiksi. Työssä kehitettiin kahteen polymeraasiketjureaktioon perustuva V. cholerae -bakteerin tunnistusmenetelmä. Toisen menetelmän avulla pystytään tunnistamaan kaikki V. cholerae -kannat ja toinen havaitsee vain tautia aiheuttavat kannat. Lisäksi työssä vertailtiin kolmea eri PCR-laitetta. Työssä kehitetyt tunnistusmenetelmät osoittautuivat käyttökelpoisiksi ja luotettaviksi tunnistettaessa ja eroteltaessa V. cholerae -kantoja. Käytetyt PCR-laitteet antoivat samanlaiset tulokset, mikä mahdollisti tunnistusmenetelmän siirtämisen laitteiden välillä ilman, että sillä oli vaikutusta menetelmän herkkyyteen tai spesifisyyteen.
Kahta erillistä 16S rRNA -geeniin perustuvaa menetelmää yhdistettynä Sanger- ja pyrosekvensointiin hyödynnettiin tutkittaessa bakteerijäämiä kaulavaltimokudoksesta ja myyrien maksanäytteistä. Tavoitteena oli tutkia menetelmien käytettävyyttää ja vertailla menetelmiä toisiinsa. Käytetyt menetelmät osoittautuivat soveltuviksi bakteerilajien havaitsemiseen erilaisista näytematriiseista ja menetelmiä pystytään hyödyntämään tutkittaessa polymikrobisia näytteitä. Lisäksi käytetyt kaksi eri menetelmää tunnistivat samoja bakteerisukuja samoista näytteistä, mikä lisää menetelmien ja tulosten luotettavuutta.
Yersinia-bakterien sukuun kuuluu kolme ihmisille tautia aiheuttavaa lajia; Y. pestis, ruton aiheuttaja ja potentiaalinen biouhkabakteeri sekä Y. enterocolitica ja Y. pseudotuberculosis, jotka aiheuttavat suolistotulehduksia. Koska Y. pestis ja Y. pseudotuberculosis - bakteerien genomit ovat hyvin samanlaisia, kantojen tyypittäminen ja erottaminen toisistaan on haastavaa. Tässä työssä CRISPR spacer -geenialueita hyödynnettiin Yersinia-suvun kantojen tyypittämisessä. Tyypitysmenetelmä osoittautui lupaavaksi työkaluksi, vaikka toisistaan eroavien spacer-sekvenssien laaja kirjo vaikeutti kantojen ryhmittämistä ja vertailua. Lisäksi Y. pestis ja Y. pseudotuberculosis -kantojen fylogeneettistä suhdetta tutkittiin vertailemalla kantojen spacer-sekvenssejä. Yllättäen lajeilla oli hyvin vähän yhteisiä spacereita. Näin ollen tutkimus ei tuonut lisätietoa kantojen fylogeneettisistä suhteista.
Väitöskirjassa hyödynnettiin molekyylibiologisia menetelmiä potentiaalisten biologisten uhka-agenssien osoittamisessa, tunnistamisessa ja tyypittämisessä. Kehitetty PCR-menetelmä pystyttiin siirtämään kenttäkelpoiselle PCR-laitteelle, mikä tekee mahdolliseksi laitteen käyttämisen lähellä potilasta esimerkiksi epidemian aikana. Tulokset olivat valmiina muutamissa tunneissa, mikä mahdollistaa nopeat lääkinnälliset toimenpiteet. Lisäksi bakteerien 16S rRNA-geenialueen sekvensointiin perustuvia menetelmiä pystytään hyödyntämään sellaisten biologisten agenssien seulonnassa ja tunnistamisessa, joiden identifiointi tavanomaisilla menetelmillä, esimerkiksi viljelemällä, olisi haastavaa tai työlästä. CRISPR-geenialueeseen perustuvaa menetelmää
pystyttäisiin hyödyntämään bakteerien tyypityksessä, mikäli laaja referenssitietokanta olisi käytettävissä.
DNA:n sekvensointi ja viime vuosina varsinkin uuden sukupolven sekvensointimenetelmät ovat osoittautuneet käyttökelpoisiksi työkaluiksi biologisten agenssien tunnistamisessa ja tyypittämisessä. Sekvensointimenetelmiä pystytään hyödyntämään myös epidemiologisissa tutkimuksissa ja selvitettäessä taudinaiheuttajan alkuperää. Erilaiset molekyylibiologiset menetelmät ovat kehittyneet valtavasti viimevuosina ja taudinaiheuttajien tunnistamisesta on tullut nopeaa ja luotettavaa. Nopea tunnistaminen luo perustan lääkinnällisten vastatoimien aloittamiselle. Tarkka tunnistaminen ja tyypittäminen antavat myös mahdollisuuden erottaa tahallinen levitys luonnollisesta epidemiasta.
Väitöskirjan tavoitteena oli kehittää ja hyödyntää molekyylibiologisia menetelmiä biologisten uhka-agenssien nopeaa ja luotettavaa tunnistamista varten. Työn tarkoituksena oli tunnistaa ja tyypittää biologisia uhka-agensseja, olivat ne sitten luonnollisia ja tahallisesti levitettyjä. Työssä hyödynnettiin polymeraasiketjureaktiota (PCR) bakteerien tunnistamisessa sekä tautia aiheuttavien ja vaarattomien bakteerikantojen erottelussa toisistaan. Lisäksi käytettiin hyväksi 16S ribomaalisen RNA (rRNA) - geenin sekvensointia tutkittaessa polymikrobisia näytteitä, ja Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) -geenialueiden vertailua bakteerien tyypityksessä.
Kolera, Vibrio cholerae -bakteerin aiheuttama tauti, on maailmanlaajuisesti suuri kansanterveydellinen ongelma. Lisäksi Yhdysvaltain tartuntatautivirasto CDC (Centers for Disease Control and Prevention) on luokitellut V. cholerae -bakteerin yhdeksi potentiaaliseksi biouhka-agenssiksi. Työssä kehitettiin kahteen polymeraasiketjureaktioon perustuva V. cholerae -bakteerin tunnistusmenetelmä. Toisen menetelmän avulla pystytään tunnistamaan kaikki V. cholerae -kannat ja toinen havaitsee vain tautia aiheuttavat kannat. Lisäksi työssä vertailtiin kolmea eri PCR-laitetta. Työssä kehitetyt tunnistusmenetelmät osoittautuivat käyttökelpoisiksi ja luotettaviksi tunnistettaessa ja eroteltaessa V. cholerae -kantoja. Käytetyt PCR-laitteet antoivat samanlaiset tulokset, mikä mahdollisti tunnistusmenetelmän siirtämisen laitteiden välillä ilman, että sillä oli vaikutusta menetelmän herkkyyteen tai spesifisyyteen.
Kahta erillistä 16S rRNA -geeniin perustuvaa menetelmää yhdistettynä Sanger- ja pyrosekvensointiin hyödynnettiin tutkittaessa bakteerijäämiä kaulavaltimokudoksesta ja myyrien maksanäytteistä. Tavoitteena oli tutkia menetelmien käytettävyyttää ja vertailla menetelmiä toisiinsa. Käytetyt menetelmät osoittautuivat soveltuviksi bakteerilajien havaitsemiseen erilaisista näytematriiseista ja menetelmiä pystytään hyödyntämään tutkittaessa polymikrobisia näytteitä. Lisäksi käytetyt kaksi eri menetelmää tunnistivat samoja bakteerisukuja samoista näytteistä, mikä lisää menetelmien ja tulosten luotettavuutta.
Yersinia-bakterien sukuun kuuluu kolme ihmisille tautia aiheuttavaa lajia; Y. pestis, ruton aiheuttaja ja potentiaalinen biouhkabakteeri sekä Y. enterocolitica ja Y. pseudotuberculosis, jotka aiheuttavat suolistotulehduksia. Koska Y. pestis ja Y. pseudotuberculosis - bakteerien genomit ovat hyvin samanlaisia, kantojen tyypittäminen ja erottaminen toisistaan on haastavaa. Tässä työssä CRISPR spacer -geenialueita hyödynnettiin Yersinia-suvun kantojen tyypittämisessä. Tyypitysmenetelmä osoittautui lupaavaksi työkaluksi, vaikka toisistaan eroavien spacer-sekvenssien laaja kirjo vaikeutti kantojen ryhmittämistä ja vertailua. Lisäksi Y. pestis ja Y. pseudotuberculosis -kantojen fylogeneettistä suhdetta tutkittiin vertailemalla kantojen spacer-sekvenssejä. Yllättäen lajeilla oli hyvin vähän yhteisiä spacereita. Näin ollen tutkimus ei tuonut lisätietoa kantojen fylogeneettisistä suhteista.
Väitöskirjassa hyödynnettiin molekyylibiologisia menetelmiä potentiaalisten biologisten uhka-agenssien osoittamisessa, tunnistamisessa ja tyypittämisessä. Kehitetty PCR-menetelmä pystyttiin siirtämään kenttäkelpoiselle PCR-laitteelle, mikä tekee mahdolliseksi laitteen käyttämisen lähellä potilasta esimerkiksi epidemian aikana. Tulokset olivat valmiina muutamissa tunneissa, mikä mahdollistaa nopeat lääkinnälliset toimenpiteet. Lisäksi bakteerien 16S rRNA-geenialueen sekvensointiin perustuvia menetelmiä pystytään hyödyntämään sellaisten biologisten agenssien seulonnassa ja tunnistamisessa, joiden identifiointi tavanomaisilla menetelmillä, esimerkiksi viljelemällä, olisi haastavaa tai työlästä. CRISPR-geenialueeseen perustuvaa menetelmää
pystyttäisiin hyödyntämään bakteerien tyypityksessä, mikäli laaja referenssitietokanta olisi käytettävissä.
DNA:n sekvensointi ja viime vuosina varsinkin uuden sukupolven sekvensointimenetelmät ovat osoittautuneet käyttökelpoisiksi työkaluiksi biologisten agenssien tunnistamisessa ja tyypittämisessä. Sekvensointimenetelmiä pystytään hyödyntämään myös epidemiologisissa tutkimuksissa ja selvitettäessä taudinaiheuttajan alkuperää. Erilaiset molekyylibiologiset menetelmät ovat kehittyneet valtavasti viimevuosina ja taudinaiheuttajien tunnistamisesta on tullut nopeaa ja luotettavaa. Nopea tunnistaminen luo perustan lääkinnällisten vastatoimien aloittamiselle. Tarkka tunnistaminen ja tyypittäminen antavat myös mahdollisuuden erottaa tahallinen levitys luonnollisesta epidemiasta.
Kokoelmat
- Julkaisut [499]