Spectroscopy of tissue triglyceride composition : In vitro and in vivo studies

Abstract

Lipid analysis is commonly performed by gas chromatography (GC) in laboratory conditions. Spectroscopic techniques, however, are non-destructive and can be implemented noninvasively in vivo.

Excess fat (triglycerides) in visceral adipose tissue and liver is known predispose to metabolic abnormalities, collectively known as the metabolic syndrome. Insulin resistance is the likely cause with diets high in saturated fat known to impair insulin sensitivity. Tissue triglyceride composition has been used as marker of dietary intake but it can also be influenced by tissue specific handling of fatty acids. Recent studies have shown that adipocyte insulin sensitivity correlates positively with their saturated fat content, contradicting the common view of dietary effects. A better understanding of factors affecting tissue triglyceride composition is needed to provide further insights into tissue function in lipid metabolism.

In this thesis two spectroscopic techniques were developed for in vitro and in vivo analysis of tissue triglyceride composition. In vitro studies (Study I) used infrared spectroscopy (FTIR), a fast and cost effective analytical technique well suited for multivariate analysis. Infrared spectra are characterized by peak overlap leading to poorly resolved absorbances and limited analytical performance. In vivo studies (Studies II, III and IV) used proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS), an established non-invasive clinical method for measuring metabolites in vivo. 1H-MRS has been limited in its ability to analyze triglyceride composition due to poorly resolved resonances.

Using an attenuated total reflection accessory, we were able to obtain pure triglyceride infrared spectra from adipose tissue biopsies. Using multivariate curve resolution (MCR), we were able to resolve the overlapping double bond absorbances of monounsaturated fat and polyunsaturated fat. MCR also resolved the isolated trans double bond and conjugated linoleic acids from an overlapping background absorbance.

Using oil phantoms to study the effects of different fatty acid compositions on the echo time behaviour of triglycerides, it was concluded that the use of long echo times improved peak separation with T2 weighting having a negligible impact. It was also discovered that the echo time behaviour of the methyl resonance of omega-3 fats differed from other fats due to characteristic J-coupling. This novel insight could be used to detect omega-3 fats in human adipose tissue in vivo at very long echo times (TE = 470 and 540 ms).

A comparison of 1H-MRS of adipose tissue in vivo and GC of adipose tissue biopsies in humans showed that long TE spectra resulted in improved peak fitting and better correlations with GC data. The study also showed that calculation of fatty acid fractions from 1H-MRS data is unreliable and should not be used. Omega-3 fatty acid content derived from long TE in vivo spectra (TE = 540 ms) correlated with total omega-3 fatty acid concentration measured by GC.

The long TE protocol used for adipose tissue studies was subsequently extended to the analysis of liver fat composition. Respiratory triggering and long TE resulted in spectra with the olefinic and tissue water resonances resolved. Conversion of the derived unsaturation to double bond content per fatty acid showed that the results were in accordance with previously published gas chromatography data on liver fat composition.

In patients with metabolic syndrome, liver fat was found to be more saturated than subcutaneous or visceral adipose tissue. The higher saturation observed in liver fat may be a result of a higher rate of de-novo-lipogenesis in liver than in adipose tissue.

This thesis has introduced the first non-invasive method for determining adipose tissue omega-3 fatty acid content in humans in vivo. The methods introduced here have also shown that liver fat is more saturated than adipose tissue fat.

Ylipaino, metabolinen oireyhtymä ja niihin liittyvä tyypin 2 diabetes yleistyvät nopeasti ja pelkästään Suomessa on arvioitu olevan noin 450 000 tyypin 2 diabeetikkoa. Metabolisen oireyhtymän ja siihen liittyvän tyypin 2 diabeteksen arvellaan olevan seurausta kehon heikentyneestä vasteesta insuliinihormonin vaikutuksille eli ns. insuliinresistenssistä. Paljon rasvaa ja sokeria sisältävä ruokavalio altistaa painonnousulle ja insuliiniresesistenssin kehittymiselle.

Aikaisempien tutkimusten perusteella paljon tyydyttyneitä ns. kovia rasvoja sisältävää ruokavaliota on pidetty haitallisena. Kovien rasvojen haitallisuudesta on kuitenkin esitetty eriäviä mielipiteitä ja aiheesta on käyty mediassa kiivasta keskustelua. Monityydyttämättömistä rasvoista erityisesti omega-3-rasvoja pidetään terveellisinä ja niitä myydään ravintolisävalmisteina. Ruokavalion omega-3-rasvojen vaikutusmekanismit ovat kuitenkin vielä epäselviä. Tutkimukset ruokavalion rasvan koostumuksen vaikutuksesta terveyteen ovat tuottaneet ristiriitaisia tuloksia. Ruokavalion tutkiminen on vaikeaa, sillä koehenkilöiden ruokavalion luotettava seuranta on käytännössä mahdotonta.

Rasva kerääntyy kehossa pääosin ihonalaiseen rasvakudokseen, jonka on siksi ajateltu edustavan ruokavalion rasvan koostumusta. Äskettäin on kuitenkin havaittu, että ihonalaisen rasvakudoksen kovat rasvat liittyvät hyvään insuliinin vaikutukseen rasvakudoksessa. Metabolisessa oireyhtymässä rasvaa kertyy myös viskeraaliseen rasvakudokseen ja maksaan.

Rasvan koostumus määritetään yleensä kudosnäytepaloista laboratorio-olosuhteissa. Viskeraalisen rasvakudoksen ja maksan rasvan tutkiminen vaatii siten kirurgista näytteenottoa vatsan sisäisistä kudoksista. Toimenpide on koehenkilölle hankala ja komplikaatioaltis, mikä on rajoittanut näiden erityisen haitallisten rasvakertymien tutkimista.

Spektroskopiamenetelmät mahdollistavat kemiallisen analytiikan tuhoamatta näytettä. Infrapunaspektroskopia (FTIR) on laajasti käytetty kemiallinen analyysimenetelmä, jonka spektrit soveltuvat hyvin monimuuttuja-analyysiin. Magneettiresonassispektroskopia (MRS) on kliininen menetelmä, joka mahdollistaa (koehenkilöön) kajoamattoman kemiallisen analyysin magneettikuvauslaitteella. Tässä väitöskirjatyössä FTIR- ja MRS-menetelmiä laajennettiin ihmisen kudosrasvan koostumuksen analysointiin.

FTIR-menetelmän käyttöä rasvakudoksen analyysissä rajoittaa spektrien analyyttisten piikkien huono erottuvuus toisistaan. Työssä parannettiin FTIR spektrien analyysiä soveltaen matemaattista monimuuttujamenetelmää. Työn tuloksena spektripiikkien erottelu parani ja niiden luotettava erottelu tuli mahdolliseksi. FTIR kykeni erottamaan rasvaspektristä trans- ja konjugoidut linolihapot, joiden analyysi perinteisillä menetelmillä on vaikeaa.

MRS-menetelmää kehitettiin ja sovellettiin koehenkilöihin, joilla on metabolinen oireyhtymä. Uudella MRS-menetelmällä pystyttiin analysoimaan ihonalaista ja viskeraalista rasvakudosta ja maksaan kertynyttä rasvaa. Yllättävä havainto oli, että maksaan kertyvä rasva on tyydyttyneempää kuin rasvakudoksen rasva. Uudella menetelmällä pystyttiin myös ensimmäistä kertaa määrittämään ihmisen rasvakudoksen omega-3- rasvoja kajoamattomasti.

Tässä väitöskirjatyössä kehitetyt kajoamattomat kudosrasvan analysointimenetelmät avaavat uusia mahdollisuuksia tutkia kudosrasvan koostumusta ja sen yhteyttä rasva-aineenvaihdunnan häiriöihin. Metabolisen oireyhtymän potilailla havaittu maksan rasvan korkea tyydyttyneisyys verrattuna rasvakudokseen saattaa olla seurausta muuttuneesta kudosten rasvahapposynteesistä.