Maltose and maltotriose transport into ale and lager brewer's yeast strains

Abstract

Maltose and maltotriose are the two most abundant sugars in brewer s wort, and thus brewer s yeast s ability to utilize them efficiently is of major importance in the brewing process. The increasing tendency to utilize high and very-high-gravity worts containing increased concentrations of maltose and maltotriose renders the need for efficient transport of these sugars even more pronounced. Residual maltose and especially maltotriose are quite often present especially after high and very-high-gravity fermentations. Sugar uptake capacity has been shown to be the rate limiting factor for maltose and maltotriose utilization. The main aim of the present study was to find novel ways to improve maltose and maltotriose utilization during the main fermentation. Maltose and maltotriose uptake characteristics of several ale and lager strains were studied. Genotype determination of the genes needed for maltose and maltotriose utilization was performed. Maltose uptake inhibition studies were performed to reveal the dominant transporter types actually functioning in each of the strains. Temperature-dependence of maltose transport was studied for ale and for lager strains as well as for each of the single sugar transporter proteins Agt1p, Malx1p and Mtt1p. The AGT1 promoter regions of one ale and two lager strains were sequenced by chromosome walking and the promoter elements were searched for using computational methods.

The results showed that ale and lager strains predominantly use different maltose and maltotriose transporter types for maltose and maltotriose uptake. Agt1 transporter was found to be the dominant maltose/maltotriose transporter in the ale strains whereas Malx1 and Mtt1- type transporters dominated in the lager strains. All lager strains studied were found to possess a non-functional Agt1 transporter. The ale strains were observed to be more sensitive to temperature decrease in their maltose uptake compared to the lager strains. Single transporters were observed to differ in their sensitivity to temperature decrease and their temperature-dependence was shown to decrease in the order Agt1≥Malx1>Mtt1. The different temperature-dependence between the ale and lager strains was observed to be due to the different dominant maltose/maltotriose transporters ale and lager strains possessed. The AGT1 promoter regions of ale and lager strains were found to differ markedly from the corresponding regions of laboratory strains. The ale strain was found to possess an extra MAL-activator binding site compared to the lager strains.

Improved maltose and maltotriose uptake capacity was obtained with a modified lager strain where the AGT1 gene was repaired and put under the control of a strong promoter. Modified strains fermented wort faster and more completely, producing beers containing more ethanol and less residual maltose and maltotriose. Significant savings in the main fermentation time were obtained when modified strains were used. In high-gravity wort fermentations 8 20% and in very-high-gravity wort fermentations even 11 37% time savings were obtained. These are economically significant changes and would cause a marked increase in annual output from the same-size of brewhouse and fermentor facilities.

Maltoosi ja maltotrioosi ovat kaksi olutvierteen yleisintä käymiskelpoista sokeria. Panimohiivojen kyky käyttää näitä sokereita tehokkaasti on tärkeä käymisprosessin nopeuteen vaikuttava tekijä. Nykyisin käymisissä on siirrytty yhä enenevässä määrin käyttämään vahvoja vierteitä, joissa sokereita on huomattavasti enemmän perinteisiin vierteisiin verrattuna. Jäännösmaltoosia ja erityisesti maltotrioosia esiintyy usein varsinkin vahvavierrekäymisten jälkeen, mikä alentaa käymisprosessin tehokkuutta. Hiivasoluissa maltoosin ja maltotrioosin käyttöä eniten rajoittavan tekijän tiedetään olevan sokereiden kuljetus solun sisälle. Tässä väitöskirjatyössä karakterisoitiin maltoosin ja maltotrioosin kuljetukseen vaikuttavia tekijöitä ale- ja lager-hiivoilla sekä pyrittiin löytämään keinoja joilla näiden sokereiden kuljetuskykyä hiivasolun sisälle ja siten käymisen tehokkuutta pystyttäisiin parantamaan.

Tärkeimpinä tuloksina tässä työssä havaittiin, että ale- ja lager-hiivoilla maltoosin sekä maltotrioosin kuljetus tapahtuu erilaisten kuljettajaproteiinien avulla. Ale-hiivoissa Agt1- kuljettajaproteiinit vastasivat pääasiallisesti maltoosin/maltotrioosin kuljetuksesta solun sisälle ja vastaavasti lager-hiivoilla kuljetus tapahtui Malx1- ja Mtt-tyypin kuljettajien avulla. Lisäksi havaittiin, että kaikissa tutkituissa lager-hiivoissa Agt1-kuljettaja oli viallinen eikä pystynyt kuljettamaan maltoosia lainkaan. Tähän oli syynä lukuraamin muutos -mutaatio AGT1-geenissä. Mtt1-kuljettajaa koodaava geeni löydettiin vain lager-hiivoista. Ale-hiivoissa maltoosin kuljetuksen havaittiin olevan lager-hiivoja herkempi lämpötilan laskulle. Syyksi tähän havaittiin se, että pääasialliset kuljettajat ale-hiivoissa, Agt1-kuljettajat, eivät toimi tehokkaasti alhaisissa lämpötiloissa. Yksittäisten kuljettajaproteiinien lämpötilaherkkyyttä tutkittaessa havaittiin, että Malx1-tyypin kuljettajat ovat lähes yhtä herkkiä lämpötilan laskulle kuin Agt1-kuljettajat. Mtt1-tyypin kuljettajilla maltoosin kuljetusaktiivisuus sen sijaan säilyi parhaiten alhaisissa lämpötiloissa.

Maltoosin ja maltotrioosin käyttöä pystyttiin merkittävästi tehostamaan kun lager-hiivan viallinen AGT1-geeni korjattiin ja laitettiin vahvemman, glukoosilla indusoituvan, promoottorin säätelyn alle. Muokatuissa kannoissa käyminen oli nopeampaa ja näillä kannoilla valmistetuissa oluissa etanolikonsentraatio oli suurempi. Lisäksi käymisen loputtua vähemmän jäännösmaltoosia ja maltotrioosia oli jäljellä. Vahvavierrekäymisissä pääkäymiseen käytetty aika vähentyi 8-37 % riippuen käytetyn vierteen vahvuudesta ja käytetystä hiivakannasta. Tämän suuruusluokan muutoksella on suuri taloudellinen merkitys, sillä samassa ajassa saadaan valmistettua tietyn suuruisesta käymistankista enemmän tuotetta.