Two ex situ fungal technologies to treat contaminated soil

Abstract

Wood-degrading fungi are able to degrade a large range of recalcitrant pollutants which resemble the lignin biopolymer. This ability is attributed to the production of lignin-modifying enzymes, which are extracellular and non-specific. Despite the potential of fungi in bioremediation, there is still an understanding gap in terms of the technology. In this thesis, the feasibility of two ex situ fungal bioremediation methods to treat contaminated soil was evaluated.

Treatment of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)-contaminated marsh soil was studied in a stirred slurry-phase reactor. Due to the salt content in marsh soil, fungi were screened for their halotolerance, and the white-rot fungi Lentinus tigrinus, Irpex lacteus and Bjerkandera adusta were selected for further studies. These fungi degraded 40 - 60% of a PAH mixture (phenanthrene, fluoranthene, pyrene and chrysene) in a slurry-phase reactor (100 ml) during 30 days of incubation. Thereafter, B. adusta was selected to scale-up and optimize the process in a 5 L reactor. Maximum degradation of dibenzothiophene (93%), fluoranthene (82%), pyrene (81%) and chrysene (83%) was achieved with the free mycelium inoculum of the highest initial biomass (2.2 g/l). In autoclaved soil, MnP was the most important enzyme involved in PAH degradation. In non-sterile soil, endogenous soil microbes together with B. adusta also degraded the PAHs extensively, suggesting a synergic action between soil microbes and the fungus.

A fungal solid-phase cultivation method to pretreat contaminated sawmill soil with high organic matter content was developed to enhance the effectiveness of the subsequent soil combustion. In a preliminary screening of 146 fungal strains, 28 out of 52 fungi, which extensively colonized non-sterile contaminated soil, were litter-decomposing fungi. The 18 strains further selected were characterized by their production of lignin-modifying and hydrolytic enzymes, of which MnP and endo-1,4-β-glucanase were the main enzymes during cultivation on Scots pine (Pinus sylvestris) bark. Of the six fungi selected for further tests, Gymnopilus luteofolius, Phanerochaete velutina, and Stropharia rugosoannulata were the most active soil organic matter degraders. The results showed that a six-month pretreatment of sawmill soil would result in a 3.5 - 9.5% loss of organic matter, depending on the fungus applied. The pretreatment process was scaled-up for a 0.56 m3 reactor, in which perforated plastic tubes filled with S. rugosoannulata growing on pine bark were introduced into the soil. The fungal pretreatment resulted in a soil mass loss of 30.5 kg, which represents 10% of the original soil mass (308 kg). Despite the fact that Scots pine bark contains several antimicrobial compounds, it was a suitable substrate for fungal growth and promoter of the production of oxidative enzymes, as well as an excellent and cheap natural carrier of fungal mycelium.

This thesis successfully developed two novel fungal ex situ bioremediation technologies and introduce new insights for their further full-scale application. Ex situ slurry-phase fungal reactors might be applied in cases when the soil has a high water content or when the contaminant bioavailability is low; for example, in wastewater treatment plants to remove pharmaceutical residues. Fungal solid-phase bioremediation is a promising remediation technology to ex situ or in situ treat contaminated soil.

Puuta lahottavat kantasienet, erityisesti valkolahosienet ja karikkeenlahottajasienet, pystyvät hajottamaan monia erilaisia vaikeasti hajoavia ympäristömyrkkyjä. Luonnossa nämä sienet hajottavat ligniiniä solunulkoisilla entsyymeillä, jotka ovat epäspesifejä ja sen vuoksi kykeneviä hajottamaan myös muita yhdisteitä, kuten maata pilaavia orgaanisia yhdisteitä. Sieniin perustuvaa puhdistustekniikkaa ei kuitenkaan ole vielä kaupallisesti saatavilla. Tässä väitöskirjassa tutkittiin kahden sienitekniikan toteuttamiskelpoisuutta pilaantuneen maan puhdistamiseksi.

Polyaromaattisilla hiilivedyillä (PAH) pilaantuneen marskimaan käsittelyä tutkittiin sekoitettavassa bioreaktorissa. Koska marskimaa sisältää suolaa, sienet seulottiin ensimmäisessä vaiheessa suolan sietokyvyn perusteella, jolloin löydettiin kolme korkeaa suolapitoisuutta sietävää valkolahosientä: Lentinus tigrinus, Irpex lacteus ja Bjerkandera adusta. Nämä sienet hajottivat tehokkaasti PAH-seosta (fenantreeni, fluoranteeni, pyreeni, kryseeni) kolmessakymmenessä päivässä 100 ml kokoisessa reaktorissa, jossa oli 10 % maata ja loput nestettä. Prosessia testattiin myös viiden litran reaktorissa B. adusta-sienellä, jolloin glukoosin pitoisuus nesteessä, sienisiirroksen tyyppi ja biomassa optimoitiin. Kun sienisiirrosta lisättiin reaktoriin maksimimäärä (2,2 g/l) saavutettiin myös suurin hajotusteho: dibentsotiofeenista hajosi 93 %, fluoranteenista 82 %, pyreenistä 81 % ja kryseenistä 83 %. Glukoosin optimipitoisuus PAH-yhdisteiden hajotukselle oli 20 ± 3 g/l. B. adusta alkoi tuottaa mangaaniperoksidaasia (MnP) reaktorissa seitsemän päivän kasvatuksen jälkeen ja se oli todennäköisesti tärkein PAH-yhdisteitä hajottava entsyymi maassa, jossa kasvoi pelkästään B. adusta. Epästeriilissä maassa B. adusta oletettavasti hajotti PAH-yhdisteitä yhdessä maan omien mikro-organismien kanssa.

Toinen sienitekniikkasovellus kehitettiin pilaantuneelle maalle, jossa orgaanisen aineen pitoisuus on suuri. Tällaista maata esikäsiteltäisiin sienen avulla ennen maan polttoa. Esikäsittelyn tarkoitus on maan orgaanisen aineen vähentäminen ja siten polttoprosessin tehostaminen. Sopivat sienet seulottiin 146 sienikannan joukosta, joista 34 kasvoi hyvin maahan. Näistä sienistä suurin osa eli 28 oli karikkeenlahottajasieniä. Kun parhaiten kasvaneita 18 sienikantaa kasvatettiin männyn (Pinus sylvestris) kaarnalla, ne tuottivat ligninolyyttisiä ja hydrolyyttisia entsyymejä; etenkin MnP:ia ja endo-1,4-β-glukanaasia. Kaikkein aktiivisimmin orgaanista ainetta maassa hajottivat Gymnopilus luteofolius, Phanerochaete velutina ja Stropharia rugosoannulata. Tulosten perusteella arvioitiin, että saha-alueen maan esikäsittelyllä saavutettaisiin 3.5 - 9.5 % orgaanisen aineen hävikki kuudessa kuukaudessa sienilajista riippuen. Maan esikäsittelyä testattiin myös 0.56 m3 reaktorissa, johon sienisiirros lisättiin verkkomaisissa muoviputkissa. Putket sisälsivät kaarnalla kasvavaa S. rugosoannulataa, joka levisi putkien raoista maahan koko reaktorissa. Maan massahävikki esikäsittelyssä oli 30,5 kg, eli n. 10 % maan alkuperäisestä massasta (308 kg).

Männyn kaarnan käyttökelpoisuus sienen ravinteeksi maan käsittelyssä arvioitiin, ja kaarnan kemiallinen koostumus määritettiin. Kaarna sisälsi 45 % ligniiniä, 25 % selluloosaa ja 15 % hemiselluloosaa. Uuteaineista yleisimmät olivat hartsihapot (etenkin dehydroabietiinihappo) ja sitosteroli. Tyydyttymättömien rasvahappojen (UFA) pitoisuus oli korkea, koostuen pääasiassa oleiinihaposta, linolihaposta ja linoleenihaposta. Kaarnassa kasvaessaan sekä P. velutina että S. rugosoannulata hajottivat kaarnan kaikkia makromolekyylejä yhtäaikaisesti. Vaikka kaarna sisältää useita mikrobien kasvua ehkäiseviä yhdisteitä, sienet kasvoivat siinä hyvin tuottaen kasvaessaan erityisesti MnP:ia ja endo-1,4-β-glukanaasia. Tyydyttämättömien rasvahappojen hajoaminen oli samanaikaista kuin ligniinin hajoaminen ja MnP:n tuoton huippukohta. Tulos viittaisi siihen, että lipidiperoksidaatio eli rasvojen hapettuminen edisti osaltaan ligniinin hajoamista.

Pilaantuneen maan käsittely sienitekniikalla tarjoaa vaihtoehtoisen menetelmän vakiintuneille menetelmille, kuten stabilointi ja poltto. Reaktoria voitaisiin hyödyntää tapauksissa, joissa maan vesipitoisuus on suuri tai kun pilaavan yhdisteen biosaatavuus on alhainen, esimerkiksi lääkejäämien poistoon jätevesistä. Pilaantuneille maamassoille sienitekniikkaa voitaisiin soveltaa sekä ex situ että in situ. Hinnaltaan edullinen männyn kaarna sopii sienten kasvualustaksi ja sienisiirroksen kantaja-aineeksi erinomaisesti edistäen hapettavien entsyymien tuottoa.