Molecular mechanisms of bacteriophage phi6 RNA-dependent RNA polymerase and its utilization in biotechnology

Abstract

Double-stranded RNA (dsRNA) viruses encode only a single protein species that contains RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) motifs. This protein is a central component in the life cycle of a dsRNA virus, carrying out both RNA transcription and replication. The architecture of viral RdRPs resembles that of a 'cupped right hand' with fingers, palm and thumb domains. Those applying de novo initiation have additional structural features, including a flexible C-terminal domain that constitutes the priming platform. Moreover, viral RdRPs must be able to interact with the incoming 3'-terminus of the template and position it so that a productive binary complex is formed. Bacteriophage phi6 of the Cystoviridae family is to date one of the best studied dsRNA viruses. The purified recombinant phi6 RdRP is highly active in vitro and possesses both RNA replication and transcription activities. The extensive biochemical observations and the atomic level crystal structure of the phi6 RdRP provides an excellent platform for in-depth studies of RNA replication in vitro.

In this thesis, targeted structure-based mutagenesis, enzymatic assays and molecular mapping of phi6 RdRP and its RNA were used to elucidate the formation of productive RNA-polymerase binary complexes. The positively charged rim of the template tunnel was shown to have a significant role in the engagement of highly structured ssRNA molecules, whereas specific interactions further down in the template tunnel promote ssRNA entry to the catalytic site. This work demonstrated that by aiding the formation of a stable binary complex with optimized RNA templates, the overall polymerization activity of the phi6 RdRP can be greatly enhanced. Furthermore, proteolyzed phi6 RdRPs that possess a nick in the polypeptide chain at the hinge region, which is part of the extended loop, were better suited for catalysis at higher temperatures whilst favouring back-primed initiation. The clipped C-terminus remains associated with the main body of the polymerase and the hinge region, although structurally disordered, is involved in the control of C-terminal domain displacement.

The accumulated knowhow on bacteriophage phi6 was utilized in the development of two technologies for the production of dsRNA: (i) an in vitro system that combines the T7 RNA polymerase and the phi6 RdRP to generate dsRNA molecules of practically unlimited length, and (ii) an in vivo RNA replication system based on restricted infection with phi6 polymerase complexes in bacterial cells to produce virtually unlimited amounts of dsRNA. The pools of small interfering RNAs derived from dsRNA produced by these systems were validated and shown to efficiently decrease the expression of both exogenous and endogenous targets.

RNA-virukset infektoivat hyvin monenkaltaisia eliöitä aina kasveista eläimiin ja ihmisiin ja ovat siten lääketieteellisesti ja taloudellisesti merkittäviä taudin aiheuttajia. Keskeinen tekijä RNA-virusten elinkaaressa on RNA:sta riippuvainen RNA-polymeraasi (lyhenne RdRP), joka monistaa viruksen genomia (replikaatio) ja syntetisoi virusperäistä lähetti-RNA:ta (transkriptio). Jokaisessa viruksessa on ainoastaan yksi polypeptidityyppi, joka toimii katalyyttisenä yksikkönä (polymeraasina) viruksen genomin monistumisessa. Vaikka RNA-virusten genomit ovat hyvinkin erilaisia ja niissä ilmenee vain vähäistä sekvenssisamankaltaisuutta, niiden polymeraasit ovat rakenteeltaan hämmästyttävän samankaltaisia.

Tämän väitöskirjan aiheena on erään prokaryoottisen malliviruksen, bakteriofaagi phi6:n polymeraasin yksityiskohtaisen toiminnan selvittäminen. Tutkimusryhmämme on jo usean vuosikymmenen ajan tutkinut cystoviruksiin kuuluvaa phi6-faagia, tavoitteena saavuttaa atomitason tarkkuus ja ymmärrys sen polymeraasin toiminnasta. Olemme onnistuneet selvittämään phi6 polymeraasin replikaatiomekanismin eri vaiheita aloituksesta ketjun pidennyksen kautta RNA-synteesin lopetukseen. Kyseinen polymeraasi on siten parhaiten karakterisoitu RNA-viruksen replikaatiomalli. RNA-polymeraasien konservoituneesta rakenteesta johtunen phi6-polymeerasilla tehty työ edesauttaa muiden RNA-polymeraasien rakenteen ja toiminnan selvittämistä ja ymmärtämistä.

Väitöskirjan kaksi ensimmäistä osajulkaisua keskittyvät tiettyihin toistaiseksi huonosti tunnettuihin vaiheisiin phi6-polymeraasin katalysoimassa RNA:n replikaatiossa: RNA-templaatin ja polymeraasin vuorovaikutukseen ennen aloituskompleksin muodostumista ja aloitusvaiheen jälkeisestä siirtymästä ketjun pidennykseen. Kolmas osajulkaisu vastaavasti yhdistää kokonaisvaltaista tietämystämme phi6-polymeraasista ja osoittaa kuinka voimme hyödyntää sitä teollisen mittakaavan bioteknillisissä sovellutuksissa. Yksityiskohtaisen tiedon kerääminen eri virusten polymeraasien rakenteesta ja toiminnasta ei pelkästään edistä perustutkimusta vaan luo pohjan uusien bioteknillisten sovellutusten kehittämiseksi, mahdollistaen virusinfektioiden torjumisen laajalla rintamalla.

RNA virus har en förmåga att infektera mycket varierande organismer, allt från växter och djur till människor, och utgör således en ekonomiskt och medicinskt betydelsefull grupp av patogener. En mycket central faktor i RNA virusets livscykel är dess RNA-beroende RNA polymeras: ett protein som kopierar virusets ärftlighetsmassa (replikation) och syntetiserar budbärar-RNA (transkription). Varje RNA virus har endast en polypeptidtyp som utgör den katalytiskt aktiva polymeras enheten. Trots att de flesta RNA virus har en mycket divergerande ärftlighetsmassa, som uppvisar endast ringa sekvenslikhet, är grundstrukturen till deras polymeras häpnadsväckande lika.

Temat för denna avhandling är bakteriofag phi6, ett prokaryotiskt modellvirus. Vår forskningsgrupp har i ett flertal decennium undersökt bakteriofag phi6, som hör till cystovirusen, för att uppnå en detaljerad bild av viruset och dess polymeras på atomnivå. Vi har lyckats beskriva de olika skedena i phi6 polymerasets replikationsmekanism från inledning via kedjeförlängning till RNA syntesens avslutning. Ifrågavarande polymeras utgör således den till dags dato bäst beskrivna replikationsmodellen för ett RNA virus. På grund av påfallande likheter i uppbyggnad och funktion bland RNA polymeras bidrar det arbete som utförts på phi6 polymeraset till att fördjupa vår kunskap om övriga RNA polymeras.

Avhandlingens två första delpublikationer fokuserar på hittills oklara skeden i RNA replikationsprocessen hos phi6 polymeraset, d.v.s. interaktionerna som sker mellan RNA-templat och polymeras innan inledningskomplexet uppkommer, samt övergången mellan inledningsfas och kedjeförlängning. Den tredje delpublikationen ger en bild av hur phi6 polymeraset kan tillämpas i biotekniska applikationer av industriell skala. Detaljerade kunskaper gällande uppbyggnad och funktion av olika virus polymeras främjar inte enbart grundforskning utan möjliggör även utveckling av nya biotekniska tillämpningar. Dessa tillämpningar utgör grunden för ett nytt biologiskt och miljövänligt sätt att producera dubbelsträngat RNA för att motarbeta virusinfektioner på bred bas.