Factors affecting secretion and surface display of heterologous proteins in Lactococcus lactis

Abstract

Bacteria are utilized for the production of many heterologous proteins, including industrially important enzymes, pharmaceuticals and vaccines. This has resulted in an extensive research on the steps along the protein production pathway in both Gram-negative and Gram-positive bacteria, in order to understand the mechanisms involved and to develop new and better tools for optimal production. However, there is still a lack in our understanding regarding bacterial protein synthesis and the production of every target protein has to be experimentally evaluated. Even so, satisfying quantity and quality of many produced proteins have not been reached.

In some applications, including industrial production of enzymes, the aim is usually to produce high yields of the target protein. This can best be accomplished if the protein is secreted into the culture medium from where it can be purified. In other applications, e.g. bacterial delivery of an antigen to mucosal surfaces, the requirement to reach the maximum yield might not be the main goal. Instead, the production system could be optimized in order to display the target antigen on the bacterial surface, from where it could be presented to the immune system on mucosal surfaces. During the last decade, there has been an increasing interest to utilize non-pathogenic and probiotic bacteria as vehicles for the delivery of therapeutic and prophylactic molecules to mucosal surfaces. Especially, lactic acid bacteria (LAB) with putative probiotic properties are interesting candidates.

In this work, the secretion and surface display of heterologous proteins in the food-grade LAB Lactococcus lactis was studied. In the first part, the protein secretion pathway of L. lactis was complemented with the extracellular chaperone PrsA from Bacillus subtilis. With the nisin-controlled gene expression (NICE) system, PrsA was produced in an active form in L. lactis and its function was similar to its function in B. subtilis. That is, PrsA increased the secretion yield of a PrsA-target protein, whereas it had no effect on the secretion of a PrsA-nontarget protein. Even though the secretion yield increased, some of the PrsA-target protein remained partly trapped on the trans side of the cytoplasma membrane in an unprocessed form, indicating a problem at late stages of secretion.

In the second part, the secretion efficiency and surface display of different proteins were optimized. The target proteins were produced as translational fusions with the lactococcal proteinase PrtP and the lactococcal autolysin AcmA cell wall binding repeats. Different fragments, spanning the H- and W-domains of PrtP were utilized as spacers, to extend the target protein through the cell wall to the bacterial surface. With this method, two target proteins were successfully surface displayed and recognized by their respective antibodies in whole-cell enzyme-linked immunosorbent assay studies. Escherichia coli beta-lactamase (Bla) was mainly used as an easily detectable reporter protein when the first constructs were made, whereas the Lactobacillus brevis S-layer (SlpA) receptor binding domain rendered the nonadhesive L. lactis cell the ability to adhere to fibronectin and the human intestinal epithelial cell line, Intestine 407.

In the third part of the study, the aim was to employ the surface display system to construct a live bacterial mucosal vaccine against porcine post-weaning diarrhoea and oedema disease, caused by F18-positive E. coli. The secretion efficiency of the receptor-binding domain of FedF, the adhesin of F18 fimbriae, was evaluated by translational fusion of FedF-PrtP to either one of the signal peptides of L. lactis Usp45 or L. brevis SlpA. Expression in the NICE system resulted in a larger protein yield with the SlpA signal peptide, which was used in further studies. Purified secreted FedF-protein was able to bind to isolated porcine epithelial cells. For efficient surface display of the receptor binding domain of FedF several parameters were evaluated, including length of FedF protein, length of PrtP spacer, type of cell wall anchor, and host background (wild type L. lactis NZ9000 and an NZ9000htrA mutant). The strongest adhesion to isolated porcine intestinal epithelial cells was attained with a construct comprising 42 amino acid residues FedF adhesin, 516 amino acid residues PrtP spacer, and the AcmA cell wall anchor, produced in the NZ9000htrA mutant.

In the fourth study, the FedF surface display system was further developed for constitutive expression. For this, a set of artificial promoters were synthesized and used to express the gene fusion. With the strongest constitutive promoter, L. lactis cells surface displayed FedF to the same extent as with optimized nisin induction, indicating the attainment of an optimal constitutive expression level for the construct.

Användningen av bakterier till att producera proteiner för industriellt och medicinskt bruk har resulterat i intensiv forskning i mekanismerna i den bakteriella proteinproduktionsbanan med målet att öka produktionsmängderna och förbättra proteinkvaliteten. Idag råder det dock fortfarande en brist på förståelse om de involverade funktionssätten och produktionen av varje främmande protein måste prövas fram experimentellt. Trots det förekommer det flere fall där man inte lyckats uppnå tillfredställande kvalitet och/eller kvantitet av det producerade proteinet.

För vissa ändamål, t.ex. vid produktion av industriellt viktiga enzym, är målet att uppnå så stora mängder protein som möjligt. Det kan vanligen bäst åstadkommas med ett produktionssystem där bakteriecellen utsöndrar det producerade proteinet till odlingsmediet från vilket det kan isoleras i ren form. I andra fall är målet inte att producera den största möjliga mängden protein. Exempel på sådana applikationer är bakteriell transport av terapeutiska och profylaktiska peptider/proteiner till slemhinnorna i tarmen, vaginan eller luftvägarna. I sådana fall bör man istället konstruera ett optimalt produktionssystem som är lämpligt för ändamålet. Bl.a. bör man ta i beaktande om proteinet skall förbli i cytoplasman, vara bundet på bakteriens yta eller avges till det omgivande mediet. Under det senaste decenniet har användningen av icke sjukdomsframkallande bakterier för detta ändamål ökat kraftigt. Speciellt mjölksyrebakterier med probiotiska egenskaper är intressanta kandidater.

Forskningsprojektets långsiktiga mål är att framställa ett ätbart levande bakterievaccin mot Escherichia coli -infektion som ger upphov till diarré och ödemsjuka hos griskultingar vid avvänjningen. Dessa sjukdomar orsakar stora ekonomiska förluster på grisfarmer överallt i världen, även i Finland. Jämfört med traditionella injicerade vaccin skulle fördelen med ett ätbart bakterievaccin vara att det kan förhindra infektion på två sätt: 1) genom att tävla med den sjukdomsframkallande bakterien om bindningsställen och därmed förhindra den att fästa vid tarmens epitelceller och 2) genom att det kan inducera både lokal och systemisk produktion av antigenspecifika antikroppar. Om bärarbakterien dessutom har hälsobefrämjande egenskaper ökar fördelarna ytterligare. Ätbara bakterievaccin har också ekonomiska fördelar då tillverkningen är relativt enkel och givandet inte kräver speciellt skolad personal.

I delarbetena som ingår i denhär avhandlingen studerades olika faktorer som inverkar på sekretionen och ytproduktionen av främmande protein hos Lactococcus lactis, en mjölksyrebakterie som har använts för framställning av mjölksyrade produkter (ss. ost, grönsaker, bröd och korv) i årtusenden och därför anses lämplig att konsumeras av både människor och djur. Resultaten av forskningen har publicerats i fyra refereegranskade vetenskapliga publikationer.

I det första delarbetet komplementerades proteinsekretionsbanan hos L. lactis med ett extracellulärt protein, PrsA, från den grampositiva bakterien Bacillus subtilis. PrsA är ett s.k. chaperonprotein som har påvisats förbättra sekretionen av vissa främmande proteiner hos B. subtilis genom att förhindra att det genom cellmembranen transporterade omogna främmande proteinet växelverkar med komponenter i den extracellulära miljön i cellväggen. På så sätt hjälper PrsA det främmande proteinet att uppnå sin funktionella struktur genom en process som benämns veckning. I våra experiment visade sig PrsA ha en likande funktion i L. lactis som hos B. subtilis, d.v.s. PrsA förbättrade sekretionen av ett PrsA-beroende protein.

I de tre påföljande delarbetena undersöktes flera olika parametrar för utställning av främmande proteiner på L. lactis bakteriens yta. De testade parametrarna bestod av olika långa adhesinfragment samt olika signalpeptider (styr proteinets sekretion genom cellmembranen), ankare (förankrar det utsöndrade proteinet i bakteriens cellvägg) och spacers (sträcker ut proteinet genom cellväggen till bakteriecellens yta). Två olika adhesiva proteiner testades. Som modellprotein användes adhesinet SlpA från mjölksyrebakterien Lactobacillus brevis. L. lactis -bakterier som bar SlpA på ytan fick som en ny egenskap förmågan att fästa vid fibronektin (finns bl.a. i bindvävnad) och odlade tarmepitelceller från människa.

De sjukdomsalstrande E. coli -bakterierna fäster sig vid griskultingarnas tarmepitelceller med hjälp av adhesinproteint FedF som finns på toppen av långa proteinfilament på bakteriens yta, s.k. fimbrier av typen F18. Genom att konstruera L. lactis -bakterier som bar den receptorbindande delen av FedF på ytan erhölls L. lactis - bakterier som fäste vid grisens tarmepitelceller. Dessa rekombinanta bakterier är i princip nu klara för vaccinationstestning.