Epithelial-mesenchymal transition in oral squamous carcinoma cells

Abstract

In epithelial-mesenchymal transition (EMT), epithelial cells acquire traits typical for mesenchymal cells, dissociate their cell-cell junctions and gain the ability to migrate. EMT is essential during embryogenesis, but may also mediate cancer progression. Basement membranes are sheets of extracellular matrix that support epithelial cells. They have a major role in maintaining the epithelial phenotype and, in cancer, preventing cell migration, invasion and metastasis. Laminins are the main components of basement membranes and may actively contribute to malignancy.

We first evaluated the differences between cell lines obtained from oral squamous cell carcinoma and its recurrence. As the results indicated a change from epithelial to fibroblastoid morphology, E-cadherin to N-cadherin switch, and change in expression of cytokeratins to vimentin intermediate filaments, we concluded that these cells had undergone EMT. We further induced EMT in primary tumour cells to gain knowledge of the effects of transcription factor Snail in this cell model. The E-cadherin repressors responsible for the EMT in these cells were ZEB-1, ZEB-2 and Snail, and ectopic expression of Snail was able to augment the levels of ZEB-1 and ZEB-2.

We produced and characterized two monoclonal antibodies that specifically recognized Snail in cell lines and patient samples. By immunohistochemistry, Snail protein was found in mesenchymal tissues during mouse embryonal development, in fibroblastoid cells of healing skin wounds and in fibromatosis and sarcoma specimens. Furthermore, Snail localized to the stroma and borders of tumour cell islands in colon adenocarcinoma, and in laryngeal and cervical squamous cell carcinomas.

Immunofluorescence labellings, immunoprecipitations and Northern and Western blots showed that EMT induced a progressive downregulation of laminin-332 and laminin-511 and, on the other hand, an induction of mesenchymal laminin-411. Chromatin immunoprecipitation revealed that Snail could directly bind upstream to the transcription start sites of both laminin α5 and α4 chain genes, thus regulating their expression. The levels of integrin α6β4, a receptor for laminin-332, as well as the hemidesmosomal complex proteins HD1/plectin and BP180 were downregulated in EMT-experienced cells. The expression of Lutheran glycoprotein, a specific receptor for laminin-511, was diminished, whereas the levels of integrins α6β1 and α1β1 and integrin-linked kinase were increased. In quantitative cell adhesion assays, the cells adhered potently to laminin-511 and fibronectin, but only marginally to laminin-411. Western blots and immunoprecipitations indicated that laminin-411 bound to fibronectin and could compromise cell adhesion to fibronectin in a dose-dependent manner.

EMT induced a highly migratory and invasive tendency in oral squamous carcinoma cells. Actin-based adhesion and invasion structures, podosomes and invadopodia, were detected in the basal cell membranes of primary tumour and spontaneously transformed cancer cells, respectively. Immunofluorescence labellings showed marked differences in their morphology, as podosomes organized a ring structure with HD1/plectin, αII-spectrin, talin, focal adhesion kinase and pacsin 2 around the core filled with actin, cortactin, vinculin and filamin A. Invadopodia had no division between ring and core and failed to organize the ring proteins, but instead assembled tail-like, narrow actin cables that showed a talin-tensin switch. Time-lapse live-cell imaging indicated that both podosomes and invadopodia were long-lived entities, but the tails of invadopodia vigorously propelled in the cytoplasm and were occasionally released from the cell membrane. Invadopodia could also be externalized outside the cytoplasm, where they still retained the ability to degrade matrix. In 3D confocal imaging combined with in situ gelatin zymography, the podosomes of primary tumour cells were large, cylindrical structures that increased in time, whereas the invadopodia in EMT-driven cells were smaller, but more numerous and degraded the underlying matrix in significantly larger amounts. Fluorescence recovery after photobleaching revealed that the substructures of podosomes were replenished more rapidly with new molecules than those of invadopodia. Overall, our results indicate that EMT has a major effect on the transcription and synthesis of both intra- and extracellular proteins, including laminins and their receptors, and on the structure and dynamics of oral squamous carcinoma cells.

Epiteeli-mesenkyymi-muutoksessa (engl. epithelial-mesenchymal transition, EMT) epiteelisolut muuttuvat mesenkymaali- eli alkeistukikudossolujen kaltaisiksi, jolloin ne irrottautuvat toisistaan ja alustastaan ja pääsevät liikkumaan paikaltaan. EMT on välttämätön sikiökehityksen aikana, mutta voi tapahtua myös syövän pahanlaatuistumisessa. Tyvikalvot ovat epiteelisoluja tukevia soluväliaineen osia. Ne ylläpitävät epiteliaalista ulkoasua ja syövässä estävät solujen liikkumista, invaasiota ja etäpesäkkeiden muodostumista. Laminiinit ovat tyvikalvojen päärakenneosia ja niillä voi olla suuri merkitys syövän syntymisessä.

Tutkimme ensin suusyövän ja sen etäpesäkkeen solujen välisiä eroavaisuuksia. Koska havaitsimme, että solujen ulkoasu oli muuttunut epiteliaalisesta sidekudossolun kaltaiseksi, E-kadheriinin ilmentyminen oli vaihtunut N-kadheriiniin sekä sytokeratiinisäikeiden ilmentyminen vimentiiniin, totesimme, että nämä solulinjat ovat läpikäyneet EMT:n. Lisäksi aiheutimme EMT:n siirtämällä transkriptiotekijä Snailin geenin suusyöpäsolulinjaan. EMT:n aiheuttajat ja E-kadheriinin ilmentymistä vähentävät transkriptiotekijät näissä solulinjoissa olivat ZEB-1, ZEB-2 ja Snail, ja Snail voimakkaana transkriptiotekijänä pystyi itsenäisesti lisäämään ZEB-1:n ja ZEB-2:n ilmentymistä.

Kehitimme kaksi vasta-ainetta, jotka tunnistavat Snail-proteiinin solulinjoissa ja potilasnäytteissä. Vasta-aineiden avulla löysimme Snailia immunohistokemiallisissa tutkimuksissa hiiren sikiökehityksessä mesenkymaalisista kudoksista, haavan paranemisessa sidekudossolujen kaltaisista soluista, sekä fibromatoosi- ja sarkoomasyöpänäytteistä. Snailia löytyi kurkunpään ja kohdun levyepiteelisyövissä, sekä paksusuolen syövässä stroomasta ja syöpäkasvainten reuna-alueilta.

Havaitsimme, että EMT vähentää suusyöpäsoluissa tyvikalvon laminini-332:a ja laminiini-511:a ja toisaalta lisää mesenkymaalista laminiini-411:a. Snail pystyy suoraan kiinnittymään laminiini α5- ja α4-geenien säätelyalueisiin ja vaikuttamaan niiden ilmentymiseen. Laminiini-332:n reseptorina toimivan integriini α6β4:n, sekä muiden hemidesmosomiproteiinien HD1/plektiinin ja BP180:n määrät vähenivät EMT:ssä. Laminiini-511:n reseptorina toimivan luteraanin määrä väheni, kun taas integriini α6β1:n ja α1β1:n, sekä integriini-linkatun kinaasin määrät lisääntyivät. Solut kiinnittyivät voimakkaasti soluväliaineen laminiini-511:een ja fibronektiiniin, mutta heikosti laminiini-411:een. Laminiini-411 puolestaan sitoutui fibronektiiniin ja mahdollisesti esti solujen kiinnittymistä siihen.

EMT muutti suusyöpäsolut voimakkaasti liikkuviksi ja invasoiviksi. Havaitsimme suusyövässä ja pahanlaatuiseksi muuttuneessa etäpesäkkeessä solujen aktiinitukirankaan liittyviä, kiinnittymisessä ja invaasiossa toimivia solu-ulokkeita, podosomeja ja invadopodioita, jotka erosivat merkittävästi toisistaan. Podosomit koostuivat monimutkaisesta rengasrakenteesta, johon liittyivät HD1/plektiini, αII-spektriini, taliini, fokaaliadheesiokinaasi ja paksiini 2, sekä ytimestä, johon kiinnittyivät aktiini, kortaktiini, vinkuliini ja filamiini A. Invadopodioissa ei ollut rengas- tai ydinrakennetta eikä rengasrakenteen proteiineja. Elävien solujen videomikroskooppikuvaus osoitti, että podosomit ja invadopodiat ovat pitkäikäisiä rakenteita. Invadopodioiden pitkät solu-ulokkeet liikkuivat pyörivin liikkein solujen sisällä ja voivat joskus irrota solun pohjasta. Invadopodiat voivat myös ulottua solukalvon jatkeena solun ulkopuolelle, pitää yhteyttä muihin soluihin, ja hajottaa soluväliainetta. Kolmiulotteisessa mikroskopiassa havaitsimme, että podosomit olivat suuria rakenteita, kun taas invadopodiat olivat pieniä, mutta huomattavasti runsaslukuisempia ja pystyivät hajottamaan soluväliainetta paljon enemmän kuin podosomit. Podosomien rakenteet uusiutuivat nopeammin kuin invadopodioiden. Tämä työ osoittaa, että EMT:llä on suuri merkitys suusyöpäsolujen pahanlaatuistumisessa ja se vaikuttaa syöpäsolujen geenien ilmentymiseen, solunsisäisten proteiinien ja tyvikalvoproteiinien synteesiin, sekä solujen rakenteeseen ja toimintaan.