Identification of the fungal catabolic D-galacturonate pathway

Abstract

Pectin is a natural polymer consisting mainly of D-galacturonic acid monomers. Microorganisms living on decaying plant material can use D-galacturonic acid for growth. Although bacterial pathways for D-galacturonate catabolism had been described previously, no eukaryotic pathway for D-galacturonate catabolism was known at the beginning of this work. The aim of this work was to identify such a pathway.

In this thesis the pathway for D-galacturonate catabolism was identified in the filamentous fungus Trichoderma reesei. The pathway consisted of four enzymes: NADPH-dependent D-galacturonate reductase (GAR1), L-galactonate dehydratase (LGD1), L-threo-3-deoxy-hexulosonate aldolase (LGA1) and NADPH-dependent glyceraldehyde reductase (GLD1). In this pathway D-galacturonate was converted to pyruvate and glycerol via L-galactonate, L-threo-3-deoxy-hexulosonate and L-glyceraldehyde.

The enzyme activities of GAR1, LGD1 and LGA1 were present in crude mycelial extract only when T. reesei was grown on D-galacturonate. The activity of GLD1 was equally present on all the tested carbon sources. The corresponding genes were identified either by purifying and sequencing the enzyme or by expressing genes with homology to other similar enzymes in a heterologous host and testing the activities. The new genes that were identified were expressed in Saccharomyces cerevisiae and resulted in active enzymes. The GAR1, LGA1 and GLD1 were also produced in S. cerevisiae as active enzymes with a polyhistidine-tag, and purified and characterised. GAR1 and LGA1 catalysed reversible reactions, whereas only the forward reactions were observed for LGD1 and GLD1. When gar1, lgd1 or lga1 was deleted in T. reesei the deletion strain was unable to grow with D-galacturonate as the only carbon source, demonstrating that all the corresponding enzymes were essential for D-galacturonate catabolism and that no alternative D-galacturonate pathway exists in T. reesei.

A challenge for biotechnology is to convert cheap raw materials to useful and more valuable products. Filamentous fungi are especially useful for the conversion of pectin, since they are efficient producers of pectinases. Identification of the fungal D-galacturonate pathway is of fundamental importance for the utilisation of pectin and its conversion to useful products.

Pektiini on luonnon polymeeri, joka koostuu pääasiassa D-galakturonihappomonomeereista. Lahoavalla kasviaineksella elävät mikro-organismit pystyvät käyttämään D-galakturonihappoa kasvamiseen. Aiemmin on löydetty bakteerien D-galakturonaattia hajottavia aineenvaihduntareittejä mutta aitotumallisten vastaavia reittejä ei ole tunnettu. Tämän työn tarkoitus oli selvittää, kuinka aitotumalliset hajottavat D-galakturonaattia.

Tässä työssä D-galakturonaatin hajotusreitti löydettiin Trichoderma reesei -homesienestä. Reitin neljä entsyymiä olivat NADPH:sta riippuvainen D-galakturonaattireduktaasi (GAR1), L-galaktonaattidehydrataasi (LGD1), L-treo-3-deoksiheksulosonaattialdolaasi (LGA1) ja NADPH:sta riippuvainen glyseraldehydireduktaasi (GLD1). Tällä aineenvaihduntareitillä D-galakturonaatti muutettiin pyruvaatiksi ja glyseroliksi. Reitin välituotteet olivat L-galaktonaatti, L-treo-3-deoksiheksulosonaatti ja L-glyseraldehydi.

Entsyymien GAR1, LGD1 ja LGA1 aktiivisuus voitiin mitata myseeliekstrakteista vain, kun T. reesei oli kasvatettu D-galakturonaatilla. GLD1-entsyymin aktiivisuus oli läsnä kaikilla testatuilla hiilenlähteillä. Reitin entsyymejä vastaavat geenit selvitettiin joko puhdistamalla ja sekvensoimalla entsyymi tai ilmentämällä geenejä, jotka olivat homologisia muiden samankaltaisten entsyymien kanssa, heterologisessa isännässä ja mittaamalla entsyymiaktiivisuutta. Kaikki löydetyt geenit ilmennettiin Saccharomyces cerevisiae -hiivasienessä ja tuotetut entsyymit olivat aktiivisia. Entsyymit GAR1, LGA1 ja GLD1 tuotettiin S. cerevisiae -hiivasienessä aktiivisena myös polyhistidiinihännän kanssa, ja ne puhdistettiin ja niiden ominaisuuksia tutkittiin. GAR1 ja LGA1 katalysoivat reaktiota molempiin suuntiin, kun taas LGD1:llä ja GLD1:llä voitiin nähdä vain yhdensuuntainen reaktio. Kun geeni gar1, lgd1 tai lga1 poistettiin T. reesei -homesienestä, tuotettu kanta ei pystynyt kasvamaan käyttäen D-galakturonaattia ainoana hiilenlähteenä. Se osoitti, että vastaavat entsyymit olivat välttämättömiä D-galakturonaatin hajotuksessa ja että T. reesei -homesienellä ei ole muita vaihtoehtoisia hajotusreittejä.

Yksi bioteknologian haasteista on tuottaa halvasta raaka-aineesta hyödyllisiä ja arvokkaita tuotteita. Rihmamaiset sienet ovat erityisen käyttökelpoisia pektiinin hyödyntämisessä, koska ne tuottavat tehokkaasti pektinaaseja. Homesienen D-galakturonaatin hajotusreitin selvittäminen on keskeisen tärkeää pektiinin hyödyntämiselle ja muuttamiselle käyttökelpoisiksi tuotteiksi.