Plant secondary metabolites in Peucedanum palustre and Angelica archangelica and their plant cell cultures

Abstract

A reversed-phase, high-performance liquid chromatographic method (RP-HPLC) with atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometry (APCI-MS) detection was developed utilising Turbo Method Development® and DryLab® programmes for the separation and identification of coumarins in Peucedanum palustre L. (Moench) and Angelica archangelica (L.) var. archangelica both belonging to the endemic flora of Finland. Fifteen coumarins were identified both in P. palustre and in A. archangelica. This is the first report on the xanthotoxin, isopimpinellin, pimpinellin, and coumarin composition of the umbels of P. palustre.

The coumarin composition of Finnish P. palustre populations was analyzed and verified chromatographically. The main coumarin in roots was oxypeucedanin, and in aerial parts peulustrin/isopeulustrin. The highly varying total coumarin concentration was the highest in umbels and the lowest in stems. Leaves and roots contained comparable amounts of coumarins. The total coumarin concentration decreased towards the north. As regards the aerial parts, the coumarin content of the umbels and leaves resembled each other the most. The effective temperature sum clearly correlated with the coumarin concentrations of the aerial parts, but not with the roots of the plant. The study did not support the existence of chemotypes in Finnish P. palustre populations.

A spontaneously embryogenic cell line of A. archangelica was established from seedlings via callus formation. The highest coumarin production was achieved after three weeks of cultivation in the medium containing 3.0% sucrose. Cryopreservation was found to be a suitable method for storing the cell line. Plantlets propagated in an air-sparged bioreactor were transferable directly to soil. The coumarin composition and levels in the regenerated plants were comparable to those in intact plants.

A mathematical computer-aided model CELLOP was constructed in which the desirability functions in a three-dimensional experimental design are used for optimising the growing conditions for plant cultures. The calcium, inorganic nitrogen, and sucrose concentrations in the medium were optimised for coumarin-producing, spontaneously embryogenic cell lines of A. archangelica and P. palustre. In comparison to the reference, the dry mass for A. archangelica was 24.7% and the coumarin concentration 40.5% higher in the optimised conditions, and the dry mass for P. palustre 61.8% and the coumarin concentration 58.1% higher. For A. archangelica the highest embryogenic activity occurred in the medium containing 1.25 mM calcium and for P. palustre in the medium containing 50.0 mM NO3- and 4.01 mM NH4+.

Suomessa luonnonvaraisina kasvavien suoputken Peucedanum palustre L. (Moench) ja väinönputken Angelica archangelica (L.) var. archangelica sisältämien kumariinien erottamiseksi ja tunnistamiseksi kehitettiin analyysimenetelmä Turbo Method Development® and DryLab® menetelmänkehitysohjelmien avulla. Käänteisfaasi-suuren erotuskyvyn nestekromatografia (RP-HPLC) yhdessä ilmakehänpaineessa tapahtuvan kemiallisen ionisaation massaspektrometrian (APCI-MS) kanssa mahdollisti viidentoista kumariinirakenteisen yhdisteen tunnistamisen kummastakin kasvista, joista ksantotoksiini, isopimpinelliini ja pimpinelliini löydettiin ensimmäistä kertaa suoputkessa. Tämä on myös ensimmäinen raportti suoputken kukinnon kumariinikoostumuksesta.

Suomalaisten suoputkipopulaatioiden kumariinikoostumus määritettiin ja varmennettiin kromatografisesti. Pääkumariini juurissa oli oksipeusedaniini ja maanpäällisissä osissa peulustriini/isopeulustriini. Suuresti vaihteleva kumariinipitoisuus oli korkein kukinnoissa ja alhaisin varsissa. Lehdet ja juuret sisälsivät kumariineja samansuuruisia määriä. Maanpäällisissä osissa kukintojen ja lehtien kumariinikoostumus muistutti eniten toisiaan. Kokonaiskumariinipitoisuus pieneni kasveissa pohjoista kohti. Kasvupaikan tehollinen lämpösumma korreloi selvästi maanpäällisten osien kumariinipitoisuuden kanssa mutta ei juurien sisältämien kumariinien kanssa. Tutkimuksessa ei saatu näyttöä erilaisten kemotyyppien olemassaolosta suomalaisissa suoputkipopulaatioissa.

Spontaanisti embrygeeninen solulinja saatiin aikaiseksi väinönputken taimien muodostamasta haavasolukosta. Uuden solulinjan kumariinipitoisuus oli korkein kolmen viikon kasvatuksen jälkeen 3 % sakkaroosia sisältävässä kasvatusalustassa. Syväjäädytyksen todettiin sopivan solulinjan pitkäaikaissäilytykseen. Ilmastetussa bioreaktorissa saatiin tuotettua taimia, jotka voitiin istuttaa suoraan multaan. Uudesta solulinjasta lisättyjen ja kasvatettujen kasvien laadullinen ja määrällinen kumariinikoostumus vastasivat luonnonvaraisia kasveja.

Kasvisoluviljelmien kasvatusolosuhteiden optimointiin kehitettiin matemaattinen tietokoneavusteinen malli CELLOP, joka perustuu desirabiliteettifunktioiden käyttöön kolmiulotteisessa koejärjestelmässä. Kasvatusalustan kalsiumin, epäorgaanisen typen ja sakkaroosin pitoisuudet optimoitiin kumariineja tuottaville, spontaanisti embryogeenisille väinönputken ja suoputken soluviljelmille. Optimoiduissa olosuhteissa väinönputken kuivamassa oli 24,7 % ja kumariinipitoisuus 40,5 % korkeampi ja suoputken kuivamassa oli 61,8 % ja kumariinipitoisuus 58,1 % korkeampi kuin vertailukasvualustassa. Väinönputken korkein embryogeeninen aktiivisuus saavutettiin 1,25 mM kalsiumia sisältävässä kasvatusalustassa, ja suoputkella kasvatusalustassa, jonka nitraattipitoisuus oli 50,0 mM ja ammoniumpitoisuus 4,01 mM.