The Pseudomonas syringae-derived HrpA pilins - molecular characterization and biotechnological application of the transcripts

Abstract

Many Gram-negative bacteria pathogenic to plants and animals possess type III secretion systems that are used to cause disease. Effector proteins are injected into host cells using the type III secretion machineries. Despite vigorous studies, the nature of the secretion signal for type III secreted proteins still remains elusive. Both mRNA and proteinaceous signals have been proposed. Findings on coupling of translation to secretion by the type III secretion systems are also still contradictory.

This study dealt with the secretion signal of HrpA from Pseudomonas syringae pathovar tomato. HrpA is the major component of the type III secretion system-associated Hrp pilus and a substrate for the type III secretion systems. The secretion signal was shown to reside in the first 15 codons or amino acids, a location typical for type III secretion signals. Translation of HrpA in the absence of a functional type III secretion system was established, but it does not exclude the possibility of coupling of translation to secretion when the secretion apparatus is present.

The hrpA transcripts from various unrelated plant pathogenic bacteria were shown to be extremely stable. The biological relevance of this observation is unknown, but possible explanations include the high prevalence of HrpA protein, an mRNA secretion signal or timing of secretion. The hrpA mRNAs are stable over a wide range of temperatures, in the absence of translating ribosomes and even in the heterologous host Escherichia coli. The untranslated regions (UTRs) of hrpA transcripts from at least 20 pathovars of Pseudomonas syringae are highly homologous, whilst their coding regions exhibit low similarity. The stable nature of hrpA messenger RNAs is likely to be due to the folding of their 5’ and 3’ UTRs. In silico the UTRs seem to form stem-loop structures, the hairpin structures in the 3’ UTRs being rich in guanidine and cytosine residues.

The stable nature of the hrpA transcript redirected the studies to the stabilization of heterologous transcripts and to the use of stable messenger RNAs in recombinant protein production. Fragments of the hrpA transcript can be used to confer stability on heterologous transcripts from several sources of bacterial and eukaryotic origin, and to elevate the levels of production of the corresponding recombinant proteins several folds. hrpA transcript stabilizing elements can be used for improving the yields of recombinant proteins even in Escherichia coli, one of the most commonly used industrial protein production hosts.

Väitöskirjassa tutkittiin sekä kasvitauteja aiheuttavien bakteerien taudinaiheuttamisjärjestelmiä että teollisuudessa tuotettavien proteiinien tuotantomenetelmien parantamista. Työn tarkoituksena oli parantaa sekä kasvi- että eläintauteja aiheuttavien bakteerien tuntemusta, joka voi tulevaisuudessa johtaa tautien diagnostiikan parantumiseen ja auttaa tautien torjunnassa. Lisäksi työn tuloksia voidaan käyttää esim. pesuaine-, rehu- ja lääketeollisuuden tarvitsemien proteiinien tuotannon tehostamiseen ja tuotantokustannusten vähentämiseen.

Eläin- ja kasvitauteja aiheuttavat bakteerit kuten Salmonella, Yersinia ja Pseudomonas käyttävät samankaltaisia mekanismeja taudin aiheuttamiseen. Bakteerit siirtävät taudinaiheuttamistekijöitä eli efektoriproteiineja suoraan isäntäorganismin soluihin käyttäen nk. tyyppi III eritysjärjestelmää. Tiedot tyyppi III eritysjärjestelmän kautta eritettävien proteiinien siirtymisestä bakteerisolun ulkopuolelle ovat vielä hataria. Tyyppi III eritysjärjestelmien proteiininerityssignaaleja on tutkittu pitkään, mutta niiden olemuksesta ei ole päästy selvyyteen. Toinen runsasta huomiota saanut, mutta vielä epäselvä yksityiskohta on proteiinien tuotannon ja erityksen välinen ajallinen yhteys. Joidenkin proteiinien kohdalla on osoitettu, että proteiinit eritetään tuoton kanssa samanaikaisesti. Toisten proteiinien kohdalla taas on voitu osoittaa, että solut tuottavat suuren määrän proteiineja sisäänsä, josta ne sopivien signaalien jälkeen erittävät ne nopeasti.

Väitöskirjassa osoitetaan kasvitauteja aiheuttavan Pseudomonas syringae bakteerin tyyppi III eritysjärjestelmän osana olevan ja sen kautta erittyvän HrpA-proteiinin erityssignaalin sijaitsevan tyyppi III erityssignaaleille tyypillisessä kohdassa. HrpA proteiinia voidaan tuottaa erityksestä riippumattomasti. Lisäksi väitöskirjassa on voitu osoittaa, että HrpA-proteiinia koodaavan lähetti-RNA:n puoliintumisaika on äärimmäisen pitkä ja tämän vakauden aiheuttaa lähetti-RNA:n päiden laskostuminen hiuspinnimäiseen muotoon.

HrpA-proteiinia koodaavan lähetti-RNA:n vakaudelle osoitetaan väitöskirjassa myös teollinen käyttötarkoitus. Ko. lähetti-RNA:n avulla voidaan pidentää muiden, epävakaiden lähetti-RNA:iden puoliaikoja, joka johtaa proteiinin tuottomäärien lisääntymiseen. Tätä menetelmää voidaan käyttää monien teollisuudessa, myös lääketuotannossa tarvittavien proteiinien tuotannossa.