Preparation, structural analysis and prebiotic potential of arabinoxylo-oligosaccharides

Abstract

Arabinoxylo-oligosaccharides (AXOS) can be prepared enzymatically from arabinoxylans (AX) and AXOS are known to possess prebiotic potential. Here the structural features of 10 cereal AX were examined. AX were hydrolysed by Shearzyme® to prepare AXOS, and their structures were fully analysed. The prebiotic potential of the purified AXOS was studied in the fermentation experiments with bifidobacteria and faecal microbiota.

In AX extracted from flours and bran, high amounts of a-L-Araf units are attached to the b-D-Xylp main chain, whereas moderate or low degree of substitution was found from husks, cob and straw. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy showed that flour and bran AX contain high amounts of a-L-Araf units bound to the O-3 of b-D-Xylp residues and doubly substituted b-D-Xylp units with a-L-Araf substituents at O-2 and O-3. Barley husk and corn cob AX contain high amounts of b-D-Xylp(1→2)-a-L-Araf(1→3) side chains, which can also be found in AX from oat spelts and rice husks, and in lesser amounts in wheat straw AX.

Rye and wheat flour AX and oat spelt AX were hydrolysed by Shearzyme® (with Aspergillus aculeatus GH10 endo-1,4-b-D-xylanase as the main enzyme) for the production of AXOS on a milligram scale. The AXOS were purified and their structures fully analysed, using mass spectrometry (MS) and 1D and 2D NMR spectroscopy. Monosubstituted xylobiose and xylotriose with a-L-Araf attached to the O-3 or O-2 of the nonreducing end b-D-Xylp unit and disubstituted AXOS with two a-L-Araf units at the nonreducing end b-D-Xylp unit of xylobiose or xylotriose were produced. Xylobiose with b-D-Xylp(1→2)-a-L-Araf(1→3) side chain was also purified. These AXOS were used as standards in further identification and quantification of corresponding AXOS from the hydrolysates in high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD) analysis.

The prebiotic potential of AXOS was tested in in vitro fermentation experiments. Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 and B. longum ATCC 15707 utilized AXOS from the AX hydrolysates. Both species released L-arabinose from AXOS, but B. adolescentis consumed the XOS formed, whereas B. longum fermented the L-arabinose released. The third species tested, B. breve ATCC 15700, grew poorly on these substrates. When cultivated on pure AXOS, the bifidobacterial mixture utilized pure singly substituted AXOS almost completely, but no growth was detected with pure doubly substituted AXOS as substrates. However, doubly substituted AXOS were utilized from the mixture of xylose, XOS and AXOS. Faecal microbiota utilized both pure singly and doubly substituted AXOS. Thus, a mixture of singly and doubly substituted AXOS could function as a suitable, slowly fermenting prebiotic substance.

This thesis contributes to the structural information on cereal AX and preparation of mono and doubly substituted AXOS from AX. Understanding the utilization strategies is fundamental in evaluating the prebiotic potential of AXOS. Further research is still required before AXOS can be used in applications for human consumption.

Ravintokuidulla tarkoitetaan hiilihydraatteja, jotka eivät pilkkoudu ja imeydy ihmisen ohutsuolessa mutta fermentoituvat ainakin osittain paksusuolessa. Hemiselluloosia, joista suurimman ryhmän muodostavat ksylaanit, esiintyy kaikissa kasveissa ja ne luokitellaan ravintokuiduiksi. Ksylaanit ovat selluloosan jälkeen kasvikunnan toiseksi yleisimpiä hiilihydraatteja. Pitkäketjuiset ksylaanit koostuvat toisiinsa liittyneistä ksyloosiyksiköistä, joihin on sitoutunut erilaisia sivuryhmiä. Arabinoksylaaneissa (AX), joita esiintyy runsaasti mm. viljakasveissa (< 10 % kokojyvissä ja noin 25-35 % akanoissa, korsissa ja lehdissä), sivuryhmät ovat pääosin arabinoosia, mutta eri kasveista ja kasvinosista eristettyjen ksylaanien kemiallinen rakenne vaihtelee runsaasti. Maataloudessa ja teollisuudessa syntyy hyödyntämättä jäävää biomassaa, josta voidaan eristää suuria määriä arabinoksylaaneja. Koska kasvit ovat uusiutuva luonnonvara ja sivuvirtoja on runsaasti saatavilla, niiden hyödyntämisessä on sekä ekonomisia että ekologisia mahdollisuuksia.

Pitkäketjuisia arabinoksylaaneja voidaan pilkkoa valittujen entsyymien avulla hallitusti lyhyemmiksi pätkiksi, joita kutsutaan arabinoksylo-oligosakkarideiksi (AXOS). Oligosakkaridien, kuten frukto-, xylo- ja galakto-oligosakkaridien (FOS, XOS ja GOS), tiedetään lisäävän paksusuolessa terveyttä edistävien maitohappo- ja bifidobakteerien määrää (= prebioottinen vaikutus) ja mahdollisesti suojaavan paksusuolensyövältä fermentoitumisen aikana muodostuvien lyhytketjuisten rasvahappojen avulla. Hitaan fermentoitumisen aikana lyhytketjuisia rasvahappoja syntyy eniten, mutta edellä mainitut suoraketjuiset oligosakkaridit saattavat kuitenkin fermentoitua liian nopeasti. Tämän vuoksi halutaan löytää hitaammin fermentoituvia oligosakkarideja, jollaisia voisivat olla mm. haaroittuneet AXOS:it. Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena oli tutkia eri viljoista peräisin olevien pitkäketjuisten AX:ien rakenteita, valmistaa AX:eista lyhytketjuisia AXOS:eja ja tutkia AXOS:ien mahdollisia prebioottisia vaikutuksia. Työssä valmistettiin kuusi rakenteeltaan erilaista AXOS:ia pilkkomalla pitkäketjuista arabinoksylaania entsyymien avulla. AXOSit koostuivat 3-5 sokeriyksiköstä ja niitä pystyttiin valmistamaan hyvillä saannoilla. Tämä on ensimmäinen tutkimus, jossa selvitettiin puhdistettujen AXOS:ien prebioottisia vaikutuksia. Bifidobakteerit pystyivät fermentoimaan osan haaroittuneista AXOS:eista, mutta kaikkein haaroittuneimmat AXOS:it osoittautuivat niille liian haastaviksi. Tutkitut yksittäiset bifidobakteerilajit käyttivät selektiivisesti vain osan AXOS:ien sokeriyksiköistä, mutta useat bifidobakteerilajit yhdessä pystyivät fermentoimaan sekä AXOS:ien sisältämät ksyloosi- että arabinoosiyksiköt. AXOS:ien fermentoitumista tutkittiin myös sekapopulaatioilla ulostekasvatusten avulla. Ulosteen sisältämät mikrobit pystyivät fermentoimaan kaikki AXOS:it täydellisesti ja AX:it lähes kokonaan.

Tämän työn perusteella voidaan sanoa, että prebioottisesti vaikuttavan tuotteen tulisi sisältää eriasteisesti haaroittuneita AXOSeja sekä mahdollisesti pitkäketjuisia AX:ja, joista suolistossa muodostuu AXOS:ja mikrobien vaikutuksesta. Ennen kuin AXOS:eja voidaan hyödyntää ihmisen ravinnossa, tarvitaan kuitenkin vielä lisää tutkimusta niiden ominaisuuksista ja fysiologisista vaikutuksista.