Stereoselectivity of the Human UDP-glucuronosyltransferases : Studies on Androgens and Propranolol Glucuronidation

Abstract

Metabolic reactions are divided into functionalization and conjugation reactions. Uridine diphosphoglucuronosyltransferases (UGTs) are an important group of conjugative enzymes that catalyze the transfer of a sugar molecule to the substrate. In humans, 19 UGT enzymes are expressed in a tissue specific manner. Human UGTs are divided into subfamilies: UGT1A, UGT2A and UGT2B. Most UGTs have broad substrate selectivity and are involved in the metabolism of different endogenous and exogenous molecules. The steroids in the human circulation are mainly glucuronidated by UGT2B subfamily enzymes. Among steroids many stereoisomeric pairs are found. Stereoisomers differ from each other in the spatial orientation of the atoms. Mirror images are called enantiomers. In biological environments stereoisomers are differentiated. The current study is concerned with stereo- and regioselectivity of UGTs toward propranolol enantiomers and endogenous steroids. Stereoisomers offer a valuable tool in examination of UGT selectivity toward the substrates. Kinetic characterization of the reactions and inhibition studies can be used to further analyze the efficiency and type of the enzymatic reaction.

The studies of this thesis were conducted with human recombinant UGTs incubated with the selected androgens and propranolol. Analysis was done by liquid chromatograph equipped with either ultraviolet or fluorescence detector, or a mass spectrometer. Propranolol was glucuronidated with opposite stereoselectively by UGT1A9 and UGT1A10, two closely related enzymes. The results also suggest the role of intestinal UGT1A10 in the stereoselective first pass metabolism of propranolol. Extrahepatic UGT2A1 was also active, showing low affinity and not discriminating propranolol enantiomers. Positive cooperativity was suggested in the reaction between propranolol enantiomers and UGT2A1.

Endogenous C19-steroids were studied. Testosterone was mainly glucuronidated by UGT2B17, an enzyme that is absent in some individuals. Testosterone glucuronidation by UGT2B17 was inhibited with its diastereomeric pair epitestosterone, which is a high affinity substrate of UGT2B7, but not UGT2B17. Minor inhibition also occurred by a common non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID) diclofenac, but not ibuprofen. Both NSAIDs, however, inhibited UGT2B15. Other studied androgens were mostly glucuronidated by UGT2B7, 2B15, 2B17 and, often, UGT2A1. UGT2B15 was strictly regio and stereoselective toward 17β-OH bearing steroids, whereas UGT2B17 accepted both 3α- and 17β-OH. If both were available, the 17β-OH was favored over 3α-OH. UGT2B7 accepted both 3α- and 17α-OH, but not 17β-OH, which also significantly impaired the glucuronidation reaction when available in the molecule. For UGT2B7, structures with 17β-OH seem to act as a competitive inhibitor for 3-O-glucuronidation if the Km is not very low. Interestingly, 17α-OH as in epitestosterone served as a low Km substrate that was not inhibited by testosterone with 17β-OH. The results shed new light on the selectivity of human UGTs toward endogenic C19 steroids.

Aineenvaihdunta eli metabolia liittää erilaiset kemialliset reaktiot elimistön toiminnan kannalta järkeväksi kokonaisuudeksi. Metaboliset reaktiot kohtaavat niin sisäsyntyisiä aineita, kuten hormoneita ja hermoston välittäjäaineita, kuin elimistöön annosteltuja yhdisteitäkin. Jälkimmäinen ryhmä, elimistön ulkopuoliset aineet, käsittää muun muassa lääke- ja ravintoaineet sekä ilmansaasteet; siis kaikki kemialliset yhdisteet jotka voivat joutua elimistöön eri annostelureittien kautta. Metabolian päätarkoituksena on lopettaa yhdisteen biologinen vaikutus ja helpottaa sen erittymistä ulos kehosta, vaikka jotkut metaboliareaktiot voivat johtaa myös aineen biologisen vaikutuksen lisääntymiseen. Useimmat aineet poistuvat metabolian lopputuotteina virtsaan tai sappeen, minkä vuoksi on edullista, että aineiden vesiliukoisuus reaktioiden tuloksena kasvaa. Metabolia voidaan jaotella ensimmäisen ja toisen vaiheen reaktioihin. Toisen vaiheen reaktioille on tyypillistä, että vastaanottajana toimivaan yhdisteeseen liitetään eli konjugoidaan suurehko ryhmä, joka merkittävästi lisää yhdisteen vesiliukoisuutta. Tärkeimpiä toisen vaiheen metaboliaentsyymeitä ovat uridiinidifosfoglukuronosyylitransferaasit (UGT:t). Ne välittävät hyvin vesiliukoisen sokeriryhmän liittämistä substraattiin.

Ihmisellä on 19 erilaista UGT-entsyymiä, jotka ilmentyvät monissa kudoksissa. Useimmiten yhdenlainen UGT-entsyymi ottaa osaa useiden erilaisten yhdisteiden metaboliaan, ja samanaikaisesti yksittäinen yhdiste metaboloituu monen UGT-entsyymin avustamana. UGT-entsyymien kolmiulotteista rakennetta tai niitä tekijöitä, jotka määrittelevät, mikä 19:stä UGT:sta metaboloi tiettyjä yhdisteitä (substraattiselektiivisyys), ei tunneta. UGT-entsyymien substraattiselektiivisyyttä tutkitaan kokeellisesti esimerkkiyhdisteiden avulla. Väitöskirjatyössä on tutkittu UGT-entsyymien substraattiselektiivisyyttä käyttäen malliaineina molekyylien stereoisomeereja.

Tutkimuksessa käytetyt ihmisen UGT-entsyymit on tuotettu geeniteknologian avulla hyönteissoluissa. Selektiivisyyttä tutkittiin ensivaiheen kokeissa yhden tai muutaman näyteainepitoisuuden avulla, ja aktiivisista yhdiste-UGT pareista määritettiin reaktion laadulliset ja määrälliset ominaisuudet, eli niin sanotut entsyymikineettiset parametrit. Lisäksi tutkittiin, kuinka reaktiossa läsnä oleva toinen yhdiste vaikutti tiettyjen tutkimusyhdisteiden kinetiikkaan. Pääasiallisia tutkimusyhdisteitä olivat yleinen sydän- ja verenpainelääke propranololi sekä miessukupuolihormoni testosteroni ja sen useat ensimmäisen vaiheen aineenvaihduntatuotteet.

Tutkimuksen aikaansaannoksena saatiin uutta tietoa UGT-entsyymien substraattispesifisyydestä. Tulokset myös valaisivat kliinisesti havaittuja seikkoja tutkimusyhdisteiden glukuronidikonjugaattien erittymisestä virtsaan. Tuloksilla voi olla merkitystä myös dopinganalytiikassa, sillä urheilussa kiellettyjen aineiden toteamiseksi määritetään tiettyjen merkkiaineiden pitoisuutta virtsassa, ja olisi edullista löytää sellainen aine jonka erittymiseen ei liity voimakasta ihmisten välistä vaihtelua.