Interactions of natural products with β-lactoglobulins, members of the lipocalin family

Abstract

Natural products constitute an important source of new drugs. The bioavailability of the drugs depends on their absorption, distribution, metabolism and elimination. To achieve good bioavailability, the drug must be soluble in water, stable in the gastrointestinal tract and palatable. Binding proteins may improve the solubility of drug compounds, masking unwanted properties, such as bad taste, bitterness or toxicity, transporting or protecting these compounds during processing and storage. The focus of this thesis was to study the interactions, including ligand binding and the effect of pH and temperature, of bovine and reindeer β-lactoglobulin (βLG) with such compounds as retinoids, phenolic compounds as well as with compounds from plant extracts, and to investigate the transport properties of the βLG-ligand complex.

To examine the binding interactions of different ligands to βLG, new methods were developed. The fluorescence binding method for the evaluation of ligand binding to βLG was miniaturized from a quartz cell to a 96-well plate. A method of ultrafiltration sampling combined with high-performance liquid chromatography was developed to assess the binding of compounds from extracts.

The interactions of phenolic compounds or retinoids and βLG were investigated using the 96-well plate method. The majority of flavones, flavonols, flavanones and isoflavones and all of the retinoids included were shown to bind to bovine and reindeer βLG. Phenolic compounds, contrary to retinol, were not released at acidic pH. Those results suggest that βLG may have more binding sites, probably also on the surface of βLG.

An extract from Camellia sinensis (L.) O. Kunze (black tea), Urtica dioica L. (nettle) and Piper nigrum (black pepper) were used to evaluate whether βLG could bind compounds from plant extracts. Piperine from P. nigrum was found to bind tightly and rutin from U. dioica weakly to βLG. No components from C. sinensis bound to βLG in our experiment.

The uptake and membrane permeation of bovine and reindeer βLG, free and bound with retinol, palmitic acid and cholesterol, were investigated using Caco-2 cell monolayers. Both bovine and reindeer βLG were able to cross the Caco-2 cell membrane. Free and βLG-bound retinol and palmitic acid were transported equally, whereas cholesterol could not cross the Caco-2 cell monolayer free or bound to βLG.

Our results showed that βLG can bind different natural product compounds, but cannot enhance transport of retinol, palmitic acid or cholesterol through Caco-2 cells. Despite this, βLG, as a water-soluble binding protein, may improve the solubility of natural compounds, possibly protecting them from early degradation and transporting some of them through the stomach. Furthermore, it may decrease their bad or bitter taste during oral administration of drugs or in food preparations. βLG can also enhance or decrease the health benefits of herbal teas and food preparations by binding compounds from extracts.

Lääkeaineen biologiseen hyötyosuuteen vaikuttavat imeytyminen, jakautuminen, metabolia ja eliminoituminen. Lääkeaineen tulisi liueta veteen, pysyä muuttumattomana mahalaukussa ja maistua hyvältä. Näitä ominaisuuksia voitaisiin parantaa sitojaproteiinien avulla. Tässä väitöskirjassa tutkittiin luonnonaineiden kuten fenolisten yhdisteiden ja retinoidien sitoutumista lehmän ja poron maidosta eristettyyn proteiiniin β-laktoglobuliinin (βLG) sekä pH:n ja säilyttämisen vaikutusta sitoutumiseen. Lisäksi tutkittiin pystyykö βLG sitomaan yhdisteitä teeuutteista ja βLG:n ja βLG-ligandi-yhdistelmän kulkeutumista epiteelisolujen läpi Caco-2 solumallissa. βLG on määrältään merkittävin lehmänmaidon heraproteiini. Se kuuluu lipokaliinien proteiiniperheeseen, jonka proteiineille on ominaista solunulkoiseen kuljetukseen liittyvä tehtävä. Natiivi βLG on kahdesta proteiiniketjusta koostuva dimeeri. Monomeeri koostuu yhdeksästä antiparalleelista β-laskoksesta, joista kahdeksan muodostaa ns. β-tynnyrin. Tynnyrin sisällä on hydrofobinen tasku, johon pienet hydrofobiset ligandit voivat sitoutua.

Fluoresenssin hiipumiseen perustuvalla 96-kuoppalevymenetelmällä tutkittiin fenolisten yhdisteiden ja retonoidien sitoutumista βLG:iin. Suurin osa flavonoideista, flavonoleista, flavanoneista ja isoflavoneista sekä kaikki tutkitut retinoidit sitoutuivat lehmän ja poron βLG:iin. pH:lla oli erilainen vaikutus fenolisten yhdisteiden sitoutumiseen kuin retinolin sitoutumiseen.

Ultrasuodatus menetelmällä tutkittiin pystyykö βLG sitomaan yhdisteitä teeuutteista. Tutkimuksessa käytettiin Camellia sinensis (L.) O. Kunze (musta tee) ja Urtica dioica L. (nokkonen) –teeuutteita sekä Piper nigrum (mustapippuri) –uutetta. βLG pystyi sitomaan piperiinia mustapippuriuutteesta ja rutiinia nokkosteeuutteesta.

Lehmän ja poron βLG:n ja βLG -ligandiyhdistelmän kulkeutumista epiteelisolujen läpi tutkittiin Caco-2 soluviljelmämallilla. Tutkimuksissa käytettiin tritiumleimattua retinolia, palmitiinihappoa ja kolesterolia. Lehmän ja poron βLG kulkeutuivat Caco-2 solujen läpi, mutta ne eivät kuljettaneet retinolia, palmitiinihappoa ja kolesterolia.

Tulokset osoittavat, että βLG pystyy sitomaan erilaisia luonnonaineita, mutta ei pysty lisäämään retinolin, palmitiinihapon tai kolesterolin kulkeutumista Caco-2 solumembraanin läpi. Tästä huolimatta, βLG vesiliukoisena sitojaproteiinina voi parantaa luonnonaineiden liukoisuutta, mahdollisesti suojata niitä alkuvaiheen hajoamiselta ja kuljettaa niitä mahan happamien olosuhteiden läpi. Annosteltaessa lääkkeitä tai ravintoaineita suun kautta βLG voisi peittää myös niiden pahaa makua. Lisäksi βLG sitomalla yhdisteitä teeuutteista tai ruoka-aineista saattaa parantaa tai heikentää niissä olevien yhdisteiden terveysvaikutuksia.