Plasmids and aromatic degradation in Sphingomonas for bioremediation : Aromatic ring cleavage genes in soil and rhizosphere

Abstract

Microbial degradation pathways play a key role in the detoxification and the mineralization of polyaromatic hydrocarbons (PAHs), which are widespread pollutants in soil and constituents of petroleum hydrocarbons. In microbiology the aromatic degradation pathways are traditionally studied from single bacterial strains with capacity to degrade certain pollutant. In soil the degradation of aromatics is performed by a diverse community of micro-organisms. The aim of this thesis was to study biodegradation on different levels starting from a versatile aromatic degrader Sphingobium sp. HV3 and its megaplasmid, extending to revelation of diversity of key catabolic enzymes in the environment and finally studying birch rhizoremediation in PAH-polluted soil.

To understand biodegradation of aromatics on bacterial species level, the aromatic degradation capacity of Sphingobium sp. HV3 and the role of the plasmid pSKY4, was studied. Toluene, m-xylene, biphenyl, fluorene, phenanthrene were detected as carbon and energy sources of the HV3 strain. Tn5 transposon mutagenesis linked the degradation capacity of toluene, m-xylene, biphenyl and naphthalene to the pSKY4 plasmid and qPCR expression analysis showed that plasmid extradiol dioxygenases genes (bphC and xylE) are inducted by phenanthrene, m-xylene and biphenyl whereas the 2,4-dichlorophenoxyacetic acid herbicide induced the chlorocatechol 1,2-dioxygenase gene (tfdC) from the ortho-pathway.

A method to study upper meta-pathway extradiol dioxygenase gene diversity in soil was developed. The extradiol dioxygenases catalyse cleavage of the aromatic ring between a hydroxylated carbon and an adjacent non-hydroxylated carbon (meta-cleavage). A high diversity of extradiol dioxygenases were detected from polluted soils. The detected extradiol dioxygenases showed sequence similarity to known catabolic genes of Alpha-, Beta-, and Gammaproteobacteria. Five groups of extradiol dioxygenases contained sequences with no close homologues in the database, representing novel genes.

In rhizoremediation experiment with birch (Betula pendula) treatment specific changes of extradiol dioxygenase communities were shown. PAH pollution changed the bulk soil extradiol dioxygenase community structure and birch rhizosphere contained a more diverse extradiol dioxygenase community than the bulk soil showing a rhizosphere effect. The degradation of pyrene in soil was enhanced with birch seedlings compared to soil without birch.

The complete 280,923 kb nucleotide sequence of pSKY4 plasmid was determined. The open reading frames of pSKY4 were divided into putative conjugative transfer, aromatic degradation, replication/maintaining and transposition/integration function-encoding proteins. Aromatic degradation orfs shared high similarity to corresponding genes in pNL1, a plasmid from the deep subsurface strain Novosphingobium aromaticivorans F199. The plasmid backbones were considerably more divergent with lower similarity, which suggests that the aromatic pathway has functioned as a plasmid independent mobile genetic element. The functional diversity of microbial communities in soil is still largely unknown. Several novel clusters of extradiol dioxygenases representing catabolic bacteria, whose function, biodegradation pathways and phylogenetic position is not known were amplified with single primer pair from polluted soils. These extradiol dioxygenase communities were shown to change upon PAH pollution, which indicates that their hosts function in PAH biodegradation in soil. Although the degradation pathways of specific bacterial species are substantially better depicted than pathways in situ, the evolution of degradation pathways for the xenobiotic compounds is largely unknown. The pSKY4 plasmid contains aromatic degradation genes in putative mobile genetic element causing flexibility/instability to the pathway. The localisation of the aromatic biodegradation pathway in mobile genetic elements suggests that gene transfer and rearrangements are a competetive advantage for Sphingomonas bacteria in the environment.

Maaperän mikro-organismit (bakteerit, arkit, sienet ja alkueläimet) muodostavat valtavan lajien ja aineenvaihdunnan monimuotoisuuden kirjon. Tämä monimuotoisuus vastaa pääasiallisesti luonnossa tapahtuvasta orgaanisten ja epäorgaanisten aineiden kierrosta. Kaikki luonnolliset ja suurin osa ihmisten tuottamista yhdisteistä toimivat mikro-organismien energian lähteenä hajoten prosessissa lopulta lähtöaineiksi. Mikro-organismit hajottavat myös useita ympäristömyrkyiksi luettavia yhdisteitä. Esitumallisten (bakteerit ja arkit) eliöiden määrä maaperässä on valtava, tyypillisesti gramma maata sisältää 1-10 miljardia solua. Maailmanlaajuisesti esitumalliset eliöt sisältävät yhtä paljon hiiliyhdisteitä kuin kasvit ja kymmenen kertaa enemmän typpeä ja fosforia. Maaperän esitumallisten aineenvaihdunta tunnetaan kuitenkin heikosti, koska vain murto-osaa lajeista pystytään viljelemään laboratoriossa, mikä mahdollistaisi niiden fysiologian yksityiskohtaisen tutkimisen.

Tässä väitöskirjassa kuvattiin suomalaisesta peltomaasta eristetyn Sphingobium sp. HV3 bakteerikannan genetiikkaa ja aromaattisten hiilivetyjen hajotuskykyjä. Kehitettiin molekyylibiologinen tutkimusmenetelmä aromaattisen aineiden hajotuksesta vastaavien geenien havaitsemiseen maaperän mikrobiyhteisöissä. Menetelmällä arvioitiin koivun (Betula pendula) juuriston vaikutusta hajoittajabakteeriyhteisöihin polyaromaattisilla yhdisteillä saastuneessa maassa. Aromaattisiin hiilivetyihin kuuluu monia ympäristömyrkkyjä, jotka leviävät ihmisen toiminnan seurauksena ekosysteemiin mm. öljyvahingoissa, petrokemian teollisuuden päästöinä ja epätäydellisissä palamisreaktioissa.

Työssä osoitettiin, että Sphingobium sp. HV3 kanta pystyy hajottamaan useita erityyppisiä myös ympäristömyrkkyinä tunnettuja aromaattisia hiilivetyjä: kaksi- ja kolmirenkaisia polyaromaatteja, bifenyyliä ja fluoreenia sekä mono-aromaattisia liuottimia. Kun HV3-bakteerikannan sisältämän kehämäisen geneettisen elementin (plasmidin) pSKY4:n geenien täydellinen emäsjärjestys selvitettiin, löydettiin myös aromaattisten hiilivetyjen hajotuksessa vastaavat geenit. Hajotustien sijainti plasmidissa mahdollistaa sen siirtymisen bakteerilajista toiseen. Lisäksi hajotustien molemmilta puolilta löydettiin useita geenejä, jotka koodaavat DNA:n organisaatiomuutoksia katalysoivia entsyymejä. Tämä viittaa siihen, että hajotustie voi toimia plasmidista riippumattomana liikkuvana geneettisenä elementtinä. Plasmidit sekä niiden sisäiset liikkuvat geneettiset elementit näyttävät vaikuttavan laajalle levinneen Sphingomonas-suvun aromaattisten hajotusteiden leviämiseen ja evoluutioon.

Väitöskirjassa kehitetyllä molekyylibiologisella tutkimusmenetelmällä selvitettiin aromaattisten yhdisteiden hajotusgeenien monimuotoisuutta öljy-yhdisteillä saastuneissa maissa ja osoitettiin että saastuneet maat sisältävät lukuisia uusia geneettisiä hajotusteitä, joita ei ole kuvattu viljellyistä bakteerikannoista. Merkkigeenejä tieteelle tuntemattomista hajotusteistä havaittiin maaperässä paljon enemmän kuin tunnettuista. Koivun (Betula pendula) juuriston vaikutusta maaperän hajotusmerkkigeenien monimuotoisuuteen ja polyaromaattisten hiilivetyjen hajoamiseen tutkittiin kasvihuonekokeessa. Kokeessa osoitettiin että koivun juuristoa ympäröivässä maassa on monimuotoisempi aromaattisten yhdisteiden hajotuspopulaatio kuin juurettomassa maassa. Lisäksi koivun juuriston vaikutus näkyi tehostuneena polyaromaattisten yhdisteiden hajoamisena. Koivun istutus voi tulevaisuudessa tarjota keinon tehostaa öljyhiilivedyillä saastuneen maaperän puhdistamista samalla muuttaen joutomaan puuviljelmäksi. Tämä työ osoitti että aromaattisten hiilivetyjen hajoaminen maaperän mikrobiyhteisöissä on monimutkainen prosessi, johon osallistuu monia vielä tuntemattomia bakteerilajeja ja hajotusteitä. Tämänkaltaiset hajotustiet voivat sijaita myös siirtyvissä geneettisissä elementeissä ja siten siirtyä ei vaan genomin sisällä vaan myöskin bakteerista toiseen maaperässä.