Glucuronide Isomers: Synthesis, Structural Characterization, and UDP-glucuronosyltransferase Screening

Abstract

Drug metabolism reactions are divided into two phases. Glucuronidation is an important phase II metabolism reaction that is catalyzed by UDP-glucuronosyltransferases (UGTs). Due to glucuronic acid conjugation, bioactive compounds become inactive, and lipophilic substances become more hydrophilic, which enhances their excretion to urine and bile. Aglycones can be endogenous or exogenous compounds, such as hormones and drugs.

Synthetic glucuronide metabolites are needed as reference substances in drug research. Glucuronide conjugates have been synthesized by both chemical and enzymatic methods. The aim of this work was to study glucuronidation of aglycones that have multiple glucuronidation sites. Glucuronide isomers of dobutamine, losartan, candesartan, and zolarsartan were synthesized by enzyme-assisted methods whereas clenbuterol glucuronides were synthesized chemically using the Koenigs-Knorr reaction. The structures and the glucuronidation sites of the synthesized compounds were determined by tandem mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. From dobutamine, the glucuronide synthesis produced three O-glucuronide regioisomers. Both N- and O-glucuronides, including two acyl glucuronides, of losartan, candesartan, and zolarsartan were obtained. The Koenigs-Knorr reaction produced O-glucuronide stereoisomers of clenbuterol. The yields varied between 0.7 and 34.6% (0.5–6.8 mg).

It is important to identify active UGT isoforms in order to understand drug-drug interactions, to clarify catalytic mechanisms, to assess the structure-function relationships, and to find isoform-selective probes. In this study, the glucuronidation activity of recombinant human UGTs was assessed using the synthesized glucuronides as reference compounds. In addition, species differences in glucuronidation were studied using liver microsomes from various animals. The formation of glucuronide isomers of dobutamine, losartan, candesartan, and zolarsartan brought a new perspective to evaluation of the structure-function relationships of UGTs and the results provided new data on their substrate specificities. UGT1A10 showed versatile substrate specificity whereas UGT1A3 was highly selective towards N2 in the tetrazole ring. The glucuronidation activity of liver microsomes was different between species. Compared to animal liver microsomes, human liver microsomes glucuronidated the studied aglycones inefficiently. There were no distinct correlations between the glucuronidation properties of human liver microsomes and recombinant hepatic UGTs, so it is difficult to predict the glucuronidation in human liver microsomes from the data obtained with recombinant UGTs.

Lääkeaineiden aineenvaihdunnan, eli metabolian, selvittäminen ja tunteminen on tärkeää, jotta voidaan ymmärtää ja jopa ennustaa lääkevaikutuksen yksilöllisiä eroja sekä välttää lääkeaineiden yhteisvaikutuksia. Lääkeainemetabolia muuttaa lääkeaineen kemiallista rakennetta siten, että sen vaikutus yleensä lakkaa ja elimistö pystyy erittämään sen helpommin. Lääkeaineiden metaboliaa katalysoivat entsyymit jaotellaan I vaiheen ja II vaiheen entsyymeihin. I vaiheen entsyymit katalysoivat hapetus- pelkistys-, ja hydrolyysireaktioita. II vaiheen entsyymit katalysoivat konjugaatioreaktioita, joissa yhdisteeseen liittyy yleensä hyvin vesiliukoinen ryhmä.

Tässä työssä tutkittiin glukuronidaatioreaktiota, joka on tärkeä II vaiheen metaboliareaktio. Glukuronidaatiossa lääkeaine muodostaa glukuronihapon kanssa glukuronidikonjugaatin, ja tätä reaktiota katalysoivat entsyymit ovat nimeltään UDP-glukuronosyylitransferaaseja (UGT-entsyymejä). Tutkittaviksi lääkeaineiksi valittiin dobutamiini, losartaani, kandesartaani, tsolarsartaani ja klenbuteroli, koska niiden kemiallisessa rakenteessa on useampia kohtia, johon glukuronihappo voi konjugoitua. Näin ollen niistä voi muodostua erilaisia glukuronidi-isomeerejä.

Jotta tutkittavien yhdisteiden glukuronidien kemiallinen rakenne, erityisesti glukuronidaatiopaikka, voitiin selvittää, metaboliitit valmistettiin synteettisesti. Dobutamiini-, losartaani-, kandesartaani- ja tsolarsartaaniglukuronidit valmistettiin entsymaattisesti ja klenbuteroliglukuronidit valmistettiin käyttämällä perinteistä synteettistä kemiaa. Syntetisoidut glukuronidit eristettiin ja puhdistettiin ja niiden kemialliset rakenteet määritettiin. Kaikkiaan viidestä tutkitusta lääkeaineesta saatiin tuotettua 13 erilaista glukuronidi-isomeeriä.

Ihmisellä tiedetään olevan 19 erilaista glukuronidaatiota katalysoivaa UGT-entsyymiä. Tässä työssä seulottiin rekombinanttitekniikalla valmistettujen ihmisen UGT-entsyymien ja eri eläinlajien maksamikrosomien aktiivisuutta katalysoida tutkittujen yhdisteiden glukuronidaatiota ja erityisesti eri isomeerien muodostumista. Syntetisoituja glukuronideja käytettiin vertailuyhdisteinä. Tutkituista UGT-entsyymeistä UGT1A10 katalysoi monien eri glukuronidi-isomeerien muodostumista, sen sijaan UGT1A3 oli hyvin selektiivinen. Rekombinanttitekniikalla valmistettujen ihmisen maksassa ilmenevien UGT-entsyymien glukuronidaatiokyvystä ei voitu suoraan ennustaa, miten ihmisen maksamikrosomit glukuronidoivat tutkittavia lääkeaineita. Eri eläinlajien kyvyssä katalysoida glukuronidi-isomeerien syntymistä havaittiin olevan suuria eroja, joten lääkeaineen glukuronidaatiota ihmisessä ei voida suoraan arvioida eläinkokeista saatujen tulosten perusteella.