Development of Sample Pretreatment and Liquid Chromatographic Techniques for Antioxidative Compounds

Abstract

In this study, novel methodologies for the determination of antioxidative compounds in herbs and beverages were developed. Antioxidants are compounds that can reduce, delay or inhibit oxidative events. They are a part of the human defense system and are obtained through the diet. Antioxidants are naturally present in several types of foods, e.g. in fruits, beverages, vegetables and herbs. Antioxidants can also be added to foods during manufacturing to suppress lipid oxidation and formation of free radicals under conditions of cooking or storage and to reduce the concentration of free radicals in vivo after food ingestion. There is growing interest in natural antioxidants, and effective compounds have already been identified from antioxidant classes such as carotenoids, essential oils, flavonoids and phenolic acids.

The wide variety of sample matrices and analytes presents quite a challenge for the development of analytical techniques. Growing demands have been placed on sample pretreatment. In this study, three novel extraction techniques, namely supercritical fluid extraction (SFE), pressurised hot water extraction (PHWE) and dynamic sonication-assisted extraction (DSAE) were studied. SFE was used for the extraction of lycopene from tomato skins and PHWE was used in the extraction of phenolic compounds from sage. DSAE was applied to the extraction of phenolic acids from Lamiaceae herbs. In the development of extraction methodologies, the main parameters of the extraction were studied and the recoveries were compared to those achieved by conventional extraction techniques. In addition, the stability of lycopene was also followed under different storage conditions.

For the separation of the antioxidative compounds in the extracts, liquid chromatographic methods (LC) were utilised. Two novel LC techniques, namely ultra performance liquid chromatography (UPLC) and comprehensive two-dimensional liquid chromatography (LCxLC) were studied and compared with conventional high performance liquid chromatography (HPLC) for the separation of antioxidants in beverages and Lamiaceae herbs. In LCxLC, the selection of LC mode, column dimensions and flow rates were studied and optimised to obtain efficient separation of the target compounds. In addition, the separation powers of HPLC, UPLC, HPLCxHPLC and HPLCxUPLC were compared.

To exploit the benefits of an integrated system, in which sample preparation and final separation are performed in a closed unit, dynamic sonication-assisted extraction was coupled on-line to a liquid chromatograph via a solid-phase trap. The increased sensitivity was utilised in the extraction of phenolic acids from Lamiaceae herbs. The results were compared to those of achieved by the LCxLC system.

Väitöskirjatyössä kehitettiin näytteen esikäsittely- ja analyysimenetelmiä eräiden antioksidanttien määrittämiseen. Antioksidantit ovat yhdisteitä, jotka voivat hidastaa tai estää hapettumisreaktioita. Antioksidantteja saadaan ravinnosta ja ne ovat olennaisia elimistön puolustusmekanismille. Tärkeitä antioksidanttilähteitä ovat mm. hedelmät, juomat (mm. mehut, viini ja tee), hedelmät ja yrtit. Antioksidanteista tässä väitöskirjatyössä tutkittiin fenolisia happoja, flavonoideja ja lykopeeniä näytteistä, jotka olivat erilaiset yrtit, tomaatit, viinit ja marjamehut.

Antioksidanttien määrittämisessä elintarvikkeista tarvitaan tehokkaita analyysimenetelmiä. Ennen varsinaista analysointia näyte täytyy esikäsitellä, koska näytteet sisältävät usein lukuisia yhdisteitä, jotka voivat erota kemiallisilta ominaisuuksiltaan hyvinkin paljon. Näytteen esikäsittelytekniikoilla on tarkoituksena mahdollisimman valikoidusti eristää halutut yhdisteet näytteestä ja helpottaa varsinaista näytteen analysointia. Kiinteille näytteille tutkimuksessa käytettiin ylikriittistä fluidiuuttoa, paineistettua kuumavesiuuttoa ja dynaamista ultraääniuuttoa. Optimoitujen uuttomenetelmien edut verrattuina perinteisiin uuttotekniikoihin olivat mm. lyhentynyt uuttoaika ja pienentynyt orgaanisen liuottimen kulutus.

Väitöskirjatutkimuksen analyysimenetelminä kehitettiin yksi- ja kaksivaiheisia nestekromatografisia tekniikoita. Näiden nestekromatografiatekniikoiden erotustehokkuutta verrattiin keskenään ja havaittiin laajan kaksivaiheisen nestekromatografian olevan kaikkein tehokkain erotusmenetelmä monimutkaisille näytteille. Näytteen esikäsittely ja analysointi voitiin suorittaa yhdellä laitteistolla liittämällä suoraan dynaaminen ultraääniuutto nestekromatografiin kiinteäfaasiuuttokeräimen avulla. Laitteistolla määritettiin fenolisten happojen pieniä pitoisuuksia yrteistä ja tuloksia verrattiin laajan kaksivaiheisen nestekromatografian antamiin tuloksiin. Tutkimuksessa todettiin, että liitettäessä valikoiva näytteen esikäsittelymenetelmä kromatografialaitteistoon suoraan kiinni, voidaan myös monimutkaisesta näytteestä analysoida luotettavasti pieniä pitoisuuksia.