CADASIL: molecular studies on the most common hereditary vascular dementing disorder

Abstract

Cerebral Autosomal Dominant Arteriopathy with Subcortical Infarcts and Leukoencephalopathy (CADASIL) is the most common hereditary vascular dementia. CADASIL is a systemic disease of small and medium-sized arteries although the symptoms are almost exclusively neurological, including migraineous headache, recurrent ischemic episodes, cognitive impairment and, finally, subcortical dementia. CADASIL is caused by over 170 different mutations in the NOTCH3 gene, which encodes a receptor expressed in adults predominantly in the vascular smooth muscle cells. The function of NOTCH3 is not crucial for embryonic development but is needed after birth. NOTCH3 directs postnatal arterial maturation and helps to maintain arterial integrity. It is involved in regulation of vascular tone and in the wound healing of a vascular injury. In addition, NOTCH3 promotes cell survival by inducing expression of anti-apoptotic proteins.

NOTCH3 is a membrane-spanning protein with a large extracellular domain (N3ECD) containing 34 epidermal growth factor-like (EGF) repeats and a smaller intracellular domain with six ankyrin repeats. All CADASIL mutations are located in the EGF repeats and the majority of the mutations cause gain or loss of one cysteine residue in one of these repeats leading to an odd number of cysteine residues, which in turn leads to misfolding of N3ECD. This misfolding most likely alters the maturation, targetting, degradation and/or function of the NOTCH3 receptor. CADASIL mutations do not seem to affect the canonical NOTCH3 signalling pathway. The main pathological findings are the accumulation of the NOTCH3 extracellular domain on degenerating vascular smooth muscle cells (VSMCs), accumulation of granular osmiophilic material (GOM) in the close vicinity of VSMCs as well as fibrosis and thickening of arterial walls. Narrowing of the arterial lumen and local thrombosis cause insufficient blood flow, mainly in small arteries of the cerebral white matter, resulting in tissue damage and lacunar infarcts. CADASIL is suspected in patients with a suggestive family history and clinical picture as well as characteristic white matter alterations in magnetic resonance imaging. A definitive verification of the diagnosis can be achieved by identifying a pathogenic mutation in the NOTCH3 gene or through the detection of GOM by electron microscopy.

To understand the pathology underlying CADASIL, we have generated a unique set of cultured vascular smooth muscle cell (VSMC) lines from umbilical cord, placental, systemic and cerebral arteries of CADASIL patients and controls. Analyses of these VSMCs suggest that mutated NOTCH3 is misfolded, thus causing endoplasmic reticulum stress, activation of the unfolded protein response and increased production of reactive oxygen species. In addition, mutation in NOTCH3 causes alterations in actin cytoskeletal structures and protein expression, increased branching and abnormal node formation. These changes correlate with NOTCH3 expression levels within different VSMCs lines, suggesting that the phenotypic differences of SMCs may affect the vulnerability of the VSMCs and, therefore, the pathogenic impact of mutated NOTCH3 appears to vary in the arteries of different locations. Furthermore, we identified PDGFR- as an immediate downstream target gene of NOTCH3 signalling. Activation of NOTCH induces up-regulation of the PDGFR- expression in control VSMCs, whereas this up-regulation is impaired in CADASIL VSMCs and might thus serve as an alternative molecular mechanism that contributes to CADASIL pathology.

In addition, we have established the congruence between NOTCH3 mutations and electron microscopic detection of GOM with a view to constructing a strategy for CADASIL diagnostics. In cases where the genetic analysis is not available or the mutation is difficult to identify, a skin biopsy is an easy-to-perform and highly reliable diagnostic method. Importantly, it is invaluable in setting guidelines concerning how far one should proceed with the genetic analyses.

CADASIL (lyhenne tulee tautia kuvaavien löydösten alkukirjaimista: Cerebral Autosomal Dominant Arteriopathy with Subcortical Infarcts and Leukoencephalopathy) on yleisin perinnöllinen verisuoniperäinen dementiaa aiheuttava sairaus. Taudin oireina esiintyy migreenityyppistä päänsärkyä, toistuvia aivohalvauksia, henkisen suorituskyvyn heikentymistä ja lopulta dementiaa. Vaikka oireet ovat lähes yksinomaan neurologisia, taudin aiheuttamia muutoksia esiintyy elimistön kaikissa pienissä ja keskisuurissa valtimoissa. CADASIL-tauti aiheutuu kehitysopillisesti tärkeän NOTCH3-geenin mutaatioista, joita on tähän mennessä löydetty yli 170 erilaista. NOTCH3-geeni koodittaa NOTCH3-reseptoria, jota aikuisella ihmisellä ilmennetään lähes yksinomaan verisuonten seinämien sileälihassoluissa. NOTCH3:n toimintaa tarvitaan syntymän jälkeisessä yksilönkehityksessä ohjaamaan kehittyvien verisuonien erilaistumista valtimoiksi ja ylläpitämään valtimoiden tyypillistä rakennetta. NOTCH3 osallistuu myös verisuonten jäntevyyden säätelyyn ja on osallisena verisuonivaurioiden korjaamisessa

CADASIL-taudin on ehdotettu johtuvan mutaatioiden aiheuttamasta NOTCH3-reseptorin solunulkoisen osan väärinlaskostumisesta. NOTCH3:n mutaatioiden ei kuitenkaan ole todettu vaikuttavan NOTCH3-reseptorin klassiseen viestintäreittiin. Kudostason päälöydökset CADASIL-taudissa ovat NOTCH3-reseptorin solunulkoisen osan kertyminen rappeutuvien sileälihassolujen pinnalle, ns. granulaarisen osmiofiilisen materiaalin (GOM) kertyminen sileälihassolujen läheisyyteen sekä pienten valtimoiden seinämien paksuuntuminen sidekudoksen kertymisen vuoksi. Valtimoiden sisätilan ahtautuminen ja paikalliset verihyytymät heikentävät aivojen verenkiertoa, pääasiassa pienissä valtimoissa aivojen valkean aineen alueella, ja johtavat paikallisiin kudoskuolioihin. CADASIL-tauti voidaan varmentaa todentamalla sairauden aiheuttava NOTCH3-mutaatio DNA näytteestä tai GOM:n kertyminen ihobiopsian elektronimikroskooppisella tutkimuksella.

Väitöskirjatutkimuksen tavoitteena oli selvittää CADASIL-taudin kudosmuutoksiin johtavia molekyylimekanismeja ja luoda toimintasuunnitelma CADASIL-taudin diagnostiikkaan. Tutkimuksia varten eristimme sileälihassoluja napanuora- ja istukkaverisuonista sekä aivojen ja eräiden muiden elinten valtimoista, jotka olivat peräisin CADASIL-potilaista ja verrokkihenkilöistä. Solulinjojen valkuaisainetuotannon analyysistä saadut tulokset viittaavat siihen, että mutaatio NOTCH3-reseptorissa aiheuttaa sen väärinlaskostumista ja johtaa laskostumishäiriöiden korjaamiseen osallistuvien valkuaisaineiden vilkastuneeseen tuotantoon ja solustressiin, sekä. aiheuttaa muutoksia soluntukirangan valkuaisaineiden tuotannossa. Solun sisäisten rakenteiden tutkimus osoitti, että NOTCH3-reseptorin mutaatio aiheuttaa lisäksi rakenteellisia muutoksia solun tukirankaan. Nämä muutokset ovat voimakkaimpia aivojen valtimoista eristetyissä solulinjoissa ja korreloivat myös NOTCH3-reseptorin ilmentymisen voimakkuuteen. Tulokset viittaavat siihen, että sileälihassolujen ilmiasu voi olla erilainen eri elinten verisuonissa ja nämä erot voivat vaikuttaa kyseisten suonien alttiuteen NOTCH3-reseptorin mutaatioiden aiheuttamille muutoksille. Tunnistimme myös NOTCH3-reseptorin uuden kohdegeenin, PDGF-reseptori betan. Tämän reseptorin säätely on muuttunut CADASIL-solulinjoissa verrattuna verrokki-solulinjoihin ja PDGF viestintäreitti voi siten olla tärkeä CADASIL-taudin synnyssä.

Selvitimme NOTCH3-mutaation ja GOM kertymän elektronimikroskooppisen todentamisen välisen yhtäpitävyyden taudin määrityksessä. Tulokset osoittivat, että molemmat menetelmät ovat herkkiä ja ihobiopsian tutkiminen GOM kertymän varmentamiseksi auttaa suunniteltaessa molekyyligeneettisen tutkimuksen laajuutta.