Alterations in the intestinal microbiota of subjects diagnosed with irritable bowel syndrome

Abstract

Irritable bowel syndrome (IBS) is a functional bowel disorder, most likely with multiple interacting factors contributing to its aetiology. The intestinal microbiota has been proposed as one of these factors. The human intestinal microbiota is a rich and dynamic microbial community inhabited by 1014 microbial cells, most of which are uncultivable. Therefore, the use of molecular methods capable of detecting the uncultivable microbes is essential.

Real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) technology was assessed for the quantification of bacteria from faecal samples, and 43 assays were designed for quantifying resident, pathogenic, probiotic or IBS-related bacteria or bacterial phylotypes. With real-time PCR, a 0.01% subpopulation could be quantified from mixed faecal deoxyribonucleic acid (DNA) samples, with a linear range of five orders of magnitude. The method proved to be sensitive and accurate also with intact bacterial cells spiked to faecal samples.

The intestinal microbiota of subjects suffering from IBS was then compared with that of healthy controls. For comparing the microbiotas on a scale covering the entire community, genomic microbial DNA extracted from faecal samples was pooled according to symptom subtype and percent guanine plus cytosine (G+C) profiled. The three most diverging %G+C fractions were analysed by cloning and partial sequencing of the 16S ribosomal ribonucleic acid (rRNA) gene. The clone libraries on the whole diverged from each other, and several differences were detected in the abundances of certain phylotypes. The genera Coriobacterium and Collinsella within the phylum Actinobacteria were considerably more abundant in the pooled healthy control sample.

To analyse the quantities of putatively IBS-associated phylotypes within individual samples, real-time PCR was applied. Several significant differences were detected, including a novel clostridial 16S rRNA gene phylotype associated with mixed-subtype IBS and healthy controls and a Ruminococcus torques resembling phylotype associated with diarrhoea-predominant IBS. Diarrhoea-predominant IBS patients diverged from constipation-predominant and mixed-subtype IBS patients and the healthy controls, in a multivariate analysis of 14 phylotypes. It should be noted, however, that these results give no indication as to whether the observed alterations are a causative agent in IBS aetiology or merely a result of the altered environment in the disturbed gut.

These results support the hypothesis of intestinal bacteria having a role in IBS, and the specific phylotype-level differences detected warrant further studies for their potential use in IBS diagnostics, therapeutic trial follow-up and host-microbe interactions.

Ärtyneen suolen oireyhtymä (engl. irritable bowel syndrome, IBS) on yleinen toiminnallinen vatsavaiva, jonka syyt ovat vielä suurelta osin tuntemattomia. Ihmisen suoliston mikrobisto on yksi mahdollisista oireyhtymän taustalla olevista tekijöistä.

Suoliston mikrobisto koostuu pääasiassa bakteereista, joista suurinta osaa ei vielä kyetä kasvattamaan viljelemällä. Tutkimuksessa käytettyjen molekyylibiologisten tutkimusmenetelmien etuna on, etteivät ne edellytä bakteerien viljelyä.

Tutkimuksessa arvioitiin reaaliaikaisen polymeraasiketjureaktion (polymerase chain reaction, PCR) soveltuvuutta suoliston mikrobiston analysointiin. Lisäksi suunniteltiin analyysejä ihmisen suoliston normaaliin mikrobistoon kuuluville, patogeenisille ja ärtyneen suolen oireyhtymään yhdistetyille bakteereille. Reaaliaikaisen PCR:n todettiin olevan herkkä ja tarkka menetelmä sekä soveltuvan hyvin bakteerimäärien määrittämiseen ulostenäytteistä.

IBS-koehenkilöiden sekä terveiden verrokkien ulostenäytteiden bakteerikoostumusta verrattiin toisiinsa. Ulostenäytteistä eristettiin bakteerien perinnöllisen tiedon kantaja-aine, deoksiribonukleiinihappo (deoxyribonucleic acid, DNA). IBS-näytteet analysoitiin yhdistettynä oireyhtymän vallitsevan oireen mukaan (ripulipainotteinen IBS, ummetuspainotteinen IBS ja sekaoireinen IBS) ja terveiden verrokkien näytteet omana näytteenään. Yhdistetyt näytteet profiloitiin ja ositettiin DNA:ssa olevien guaniini- ja sytosiiniemästen suhteellisen osuuden mukaan. Kolme näytetyyppien välillä eniten eroa ilmentävää aluetta analysoitiin kloonaamalla ja sekvensoimalla bakteerien 16S-ribosomaalinen RNA-geeni (16S ribosomal ribonucleic acid, 16S rRNA). 16S rRNA -geenin sekvenssin avulla voidaan eri näytteiden bakteerikoostumusta verrata toisiinsa. Erityisesti sukujen Coriobacterium ja Collinsella bakteerien havaittiin olevan runsaslukuisempia terveiden verrokkien näytteissä.

16S rRNA – geenisekvenssejä hyödynnettiin suunnittelemalla uusia reaaliaikaisia PCR-analyysejä, joilla analysoitiin yksittäisten koehenkilöiden näytteitä ja todettiin useampia tilastollisesti merkittäviä eroja. Esimerkiksi toistaiseksi tuntemattoman klostridin havaittiin esiintyvän runsaammin sekaoireisten IBS-koehenkilöiden sekä terveiden verrokkien näytteissä. Toisaalta Ruminococcus torques -bakteerilajille läheisen 16S rRNA -geenisekvenssin havaittiin liittyvän ripulipainotteiseen IBS:ään. Ripulipainotteinen IBS erottui selkeimmin erilleen muista IBS-alatyypeistä sekä terveistä verrokeista.

Tutkimuksen tulokset tukevat hypoteesia, jonka mukaan suoliston bakteereilla on merkitystä IBS:ssä. Tutkimuksessa havaittiin ulosteiden bakteerikoostumuksessa eroja IBS-alatyyppien sekä terveiden verrokkien välillä, mutta sen tulokset eivät kerro erojen mahdollisesta yhteydestä oireyhtymän syntyyn. Todettuja eroavaisuuksia on mahdollista jatkossa hyödyntää tutkittaessa IBS-diagnostiikkaa ja -hoitoa.