Lipid-Containing Icosahedral dsDNA Bacteriophages: Entry, Exit and Structure

Abstract

In this thesis three icosahedral lipid-containing double-stranded (ds) deoxyribonucleic acid (DNA) bacteriophages have been studied: PRD1, Bam35 and P23-77. The work focuses on the entry, exit and structure of the viruses. PRD1 is the type member of the Tectiviridae family, infecting a variety of Gram-negative bacteria. The PRD1 receptor binding complex, consisting of the penton protein P31, the spike protein P5 and the receptor binding protein P2 recognizes a specific receptor on the host surface. In this study we found that the transmembrane protein P16 has an important stabilization function as the fourth member of the receptor binding complex and protein P16 may have a role in the formation of a tubular membrane structure, which is needed in the ejection of the genome into the cell. Phage Bam35 (Tectiviridae), which infects Gram-positive hosts, has been earlier found to resemble PRD1 in morphology and genome organization The uncharacterized early and late events in the Bam35 life cycle were studied by electrochemical methods. Physiological changes in the beginning of the infection were found to be similar in both lysogenic and nonlysogenic cell lines, Bam35 inducing a temporal decrease of membrane voltage and K+ efflux. At the end of the infection cycle physiological changes were observed only in the nonlysogenic cell line. The strong K+ efflux 40 min after infection and the induced premature cell lysis propose that Bam35 has a similar holin-endolysin lysis system to that of PRD1. Thermophilic icosahedral dsDNA Thermus phages P23-65H, P23-72 and P23-77 have been proposed to belong to the Tectiviridae family. In this study these phages were compared to each other. Analysis of structural protein patterns and stability revealed these phages to be very similar but not identical. The most stable of the studied viruses, P23-77, was further analyzed in more detail. Cryo-electron microscopy and three-dimensional image reconstruction was used to determine the structure of virus to 14 Å resolution. Results of thin layer chromatography for neutral lipids together with analysis of the three dimensional reconstruction of P23-77 virus particle revealed the presence of an internal lipid membrane. The overall capsid architecture of P23-77 is similar to PRD1 and Bam35, but most closely it resembles the structure of the capsid of archaeal virus SH1. This complicates the classification of dsDNA, internal lipid-containing icosahedral viruses.

Rasvakalvolliset ikosahedraaliset kaksoisjuoste-DNA bakteriofagit: sisäänmeno, poistuminen ja rakenne

Tutkimuksessa on tarkasteltu PRD1, Bam35 ja P23-77 bakteerifageja, joilla on kaksoisjuoste-DNA (dsDNA) perimä sekä ikosahedraalisen proteiinikuoren alla rasvakalvo. Tutkimus on osana laajempaa kalvollisten virusten rakennetutkimusta sekä rakenteiden perusteella tapahtuvaa virusten syntyhistoriaa sekä niiden sukulaissuhteita määrittävää tutkimusta.

PRD1 kuuluu Tectiviridae-heimoon ja infektoi Gram-negatiivista bakteeria. Tutkimus valottaa PRD1:n kulmissa olevaa reseptoriin sitoutuvaa tarttumisrakennetta (koostuu P31, P5 ja P2 proteiineista) sekä sen merkityksestä isäntäsolun infektioon. Kalvon läpäisevällä proteiinilla P16 havaittiin olevan tärkeä tarttumisrakennetta vakauttava merkitys neljäntenä rakenneosana. Mahdollisesti proteiini P16 myös vaikuttaa putkimaisen kalvorakenteen muodostumiseen, jota tarvitaan perimän kuljettamiseen isäntäsoluun.

Tectiviridae-heimoon kuuluva, Gram-positiivista bakteeria infektoiva Bam35:lla on samankaltainen perimän järjestäytyminen ja morfologia kuin PRD1:lla. Tutkimuksessa valotettiin Bam35 elinsyklin aikaisia ja myöhäisiä tapahtumia käyttäen elektokemiallisia menetelmiä. Infektion alussa fysiologiset muutokset havaittiin sekä lysogeenisessa että villi tyyppisissä isäntäsolulinjoissa. Bam35 aiheutti väliaikaisen kalvojännitteen alenemisen sekä kaliumin vapautumisen soluista. Infektiosyklin lopussa ainoastaan villi tyypin solulinjassa havaittiin fysiologisia muutoksia. Tutkimuksessa havaittu voimakas kaliumin vapautuminen solusta infektiosyklin lopussa sekä indusoimalla aikaistettu isäntäsolujen lyysi antavat olettaa, että Bam35:lla on PRD1:n kaltainen holini-endolysiini lyysijärjestelmä.

Lämpöäkestävien Thermus-bakteriofagien P23-65H, P23-72 ja P23-77 on oletettu kuuluvan Tectiviridae-heimoon. Bakteriofagien stabiliteetin ja rakenneproteiinien analysointi paljasti näiden olevan hyvin samankaltaisia toisiinsa nähden mutta ei identtisiä. Kaikista stabiilein bakteriofagi P23-77 analysoitiin pidemmälle määrittämällä 14 Å resoluutio tarkkuuteen P23-77 kolmiulotteinen rakennemalli käyttäen cryo-elektronimikroskopiaa. Yhdessä ohutlevykromatografian tulokset sekä P23-77 kolmiulotteisen rakennemallin analysointi osoittivat, että proteiinikuoren alla on rasvakalvo. Yleisesti ottaen P23-77 proteiinikuoren rakenne on samankaltainen PRD1:n ja Bam35:n kanssa mutta kaikista läheisin se on arkkivirus SH1 kanssa. Mikä vaikeuttaa rasvakalvollisten ikosahedraalisten dsDNA bakteriofagien luokitusta.