Synthesis of neoglycoconjugates and oligosaccharides with potential anti-Helicobacter pylori activity

Abstract

The significance of carbohydrate-protein interactions in many biological phenomena is now widely acknowledged and carbohydrate based pharmaceuticals are under intensive development. The interactions between monomeric carbohydrate ligands and their receptors are usually of low affinity. To overcome this limitation natural carbohydrate ligands are often organized as multivalent structures. Therefore, artificial carbohydrate pharmaceuticals should be constructed on the same concept, as multivalent carbohydrates or glycoclusters. Infections of specific host tissues by bacteria, viruses, and fungi are among the unfavorable disease processes for which suitably designed carbohydrate inhibitors represent worthy targets.

The bacterium Helicobacter pylori colonizes more than half of all people worldwide, causing gastritis, gastric ulcer, and conferring a greater risk of stomach cancer. The present medication therapy for H. pylori includes the use of antibiotics, which is associated with increasing incidence of bacterial resistance to traditional antibiotics. Therefore, the need for an alternative treatment method is urgent.

In this study, four novel synthesis procedures of multivalent glycoconjugates were created. Three different scaffolds representing linear (chondroitin oligomer), cyclic (γ-cyclodextrin), and globular (dendrimer) molecules were used. Multivalent conjugates were produced using the human milk type oligosaccharides LNDFH I (Lewis-b hexasaccharide), LNnT (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc), and GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc all representing analogues of the tissue binding epitopes for H. pylori. The first synthetic method included the reductive amination of scaffold molecules modified to express primary amine groups, and in the case of dendrimer direct amination to scaffold molecule presenting 64 primary amine groups. The second method described a direct procedure for amidation of glycosylamine modified oligosaccharides to scaffold molecules presenting carboxyl groups. The final two methods that were created both included an oxime-linkage on linkers of different length. All the new synthetic procedures synthesized had the advantage of using unmodified reducing sugars as starting material making it easy to synthesize glycoconjugates of different specificity.

In addition, the binding activity of an array of neoglycolipids to H. pylori was studied. Consequently, two new neolacto-based structures, Glcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-Cer and GlcAβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-Cer, with binding activity toward H. pylori were discovered. Interestingly, N-methyl and N-ethyl amide modification of the GlcAβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-Cer glucuronic acid residue resulted in more effective H. pylori binding epitopes than the parent molecule.

Yli puolet maailman väestöstä kantaa Gram-negatiivistä Helicobacter pylori bakteeria. Helikobakteeri-infektio hankitaan yleensä lapsuusiässä, tartunta saadaan ilmeisimmin vanhemmilta tai isovanhemmilta. Kehittyneissä maissa lasten helikobakteeri-infektio on harvinainen verrattuna sosioekonomisesti vähemmän kehittyneisiin maihin.

Mahalaukun limakalvossa olevan helikobakteeri-infektion kaikille kantajille kehittyy krooninen gastriittinen tulehdus, mutta tämä tila on usein oireeton. Tulehdus johtaa noin 10-20%:lla potilaista vuosien kuluessa maha- tai pohjukaissuolihaavan kehittymiseen. Helikobakteeri-infektio lisää mahasyövän riskiä 2-6 kertaiseksi ja sitä pidetään keskeisenä tekijänä mahan MALT-lymfooman synnyssa. Infektion saaneista 10-20%:lle bakteerikolonisaation lopputulos voi olla hengenvaarallinen. Vuonna 1994 WHO (World Health Organization) kategorisoi helikobakteerin korkeimman luokan karsinogeeniksi.

Vaikka helikobakteerin häätöhoitoon tällä hetkellä käytettävä hoito on varsin tehokas, ongelmina ovat antibiooteille resistenssien kantojen yleistyminen ja pahat sivuvaikutukset, kuten ruoansulatusjärjestelmän normaalin bakteeriflooran tuhoutuminen. Antibioottien käytöstä suuremmalle populaatiolle helikobakteerin häätöhoidossa seuraisi antibiooteille resistenssien kantojen yleistyminen entisestään. Helikobakteeri-infektion aiheuttama gastriitti, tästä edelleen aiheutuvat taudit ja syövän riskin kasvu ovat kuitenkin vakava terveysongelma, joten uusille terapiahoidoille on tarve.

Helikobakteeri infektoi tarttumalla mahan pinnan hiilihydraattirakenteisiin. Ihmisen todennäköisesti kaksi merkittävintä helikobakteerin reseptorihiilihydraattia on nyt tunnistettu. Liukoista reseptorin analogia voidaan käyttää helikobakteerin irrottamiseen mahan pinnasta. Näitä monovalenttisia reseptorianalogeja tarvitaan epäkäytännöllisen korkea määrä estämään patogeenin tarttuminen ihmiseen, kun sensijaan luonnonmukaiseen sokerirunkoon rakennetut multivalentit molekyylit voivat olla jopa miljoona kertaa tehokkaampia. Tämän tutkimuksen tavoitteena on ollut kehittää menetelmiä polyvalenttisten oligosakkaridikonjugaattien valmistamiseksi. Menetelmien todentamiseksi oli myös valmistettava polyvalenttirungot, joihin oligosakkaridiyksiköt kiinnitetään. Lisäksi tavoitteena on ollut rakentaa potentiaalisia uusia monovalenttisia helikobakteerin reseptorianalogeja ja tutkia näiden sitoutumista helikobakteeriin in vitro.

Tutkimuksessa on kehitetty neljä erilaista prosessia oligosakkaridien kiinnittämiseen hiilihydraattirunkoihin multivalenteiksi rakenteiksi. Runkorakenteita on kehitetty muokkaamalla kemiallisesti luonnollisia hiilihydraattirunkoja (γ-syklodekstriiniä ja kondroitiinisulfaattia). Kaikkien näihin runkoihin kiinnitettyjen hiilihydraattirakenteiden on aikaisemmin todettu tarttuvan helikobakteeriin. Helikobakteerin häätöhoidon lisäksi näitä multivalenttipohjia on mahdollista soveltaa muidenkin hiilihydraatteihin sitoutuvien patogeenien sitoutumisen estoon liittämällä näihin tapauskohtainen hiilihydraattiepitooppi. Lisäksi tutkittiin, in vitro, paneeli potentiaalisia uusia monovalenttisia helikobakteerin reseptorianalogeja, joista löydettiin kaksi uutta helikobakteeria sitovaa rakennetta.