Thin-Layer Chromatography with Ultraviolet and Mass Spectrometric Detection: From Preparative-Layer to Miniaturized Ultra-Thin-Layer Technique

Abstract

The present challenge in drug discovery is to synthesize new compounds efficiently in minimal time. The trend is towards carefully designed and well-characterized compound libraries because fast and effective synthesis methods easily produce thousands of new compounds. The need for rapid and reliable analysis methods is increased at the same time. Quality assessment, including the identification and purity tests, is highly important since false (negative or positive) results, for instance in tests of biological activity or determination of early-ADME parameters in vitro (the pharmacokinetic study of drug absorption, distribution, metabolism, and excretion), must be avoided. This thesis summarizes the principles of classical planar chromatographic separation combined with ultraviolet (UV) and mass spectrometric (MS) detection, and introduces powerful, rapid, easy, low-cost, and alternative tools and techniques for qualitative and quantitative analysis of small drug or “drug-like” molecules.

High performance thin-layer chromatography (HPTLC) was introduced and evaluated for fast semi-quantitative assessment of the purity of synthesis target compounds. HPTLC methods were compared with the liquid chromatography (LC) methods. Electrospray ionization mass spectrometry (ESI–MS) and atmospheric pressure matrix-assisted laser desorption/ionization MS (AP–MALDI–MS) were used to identify and confirm the product zones on the plate. AP–MALDI–MS was rapid, and easy to carry out directly on the plate without scraping. The PLC method was used to isolate target compounds from crude synthesized products and purify them for bioactivity and preliminary ADME tests.

Ultra-thin-layer chromatography (UTLC) with AP–MALDI–MS and desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI–MS) was introduced and studied for the first time. Because of the thinner adsorbent layer, the monolithic UTLC plate provided 10–100 times better sensitivity in MALDI analysis than did HPTLC plates. The limits of detection (LODs) down to low picomole range were demonstrated for UTLC–AP–MALDI– and UTLC–DESI–MS. In a comparison of AP– and vacuum MALDI–MS detection for UTLC plates, desorption from the irregular surface of the plates with the combination of an external AP–MALDI ion source and an ion trap instrument provided clearly less variation in mass accuracy than the vacuum MALDI–time-of-flight (TOF) instrument. The performance of the two-dimensional (2D) UTLC separation with AP–MALDI–MS method was studied for the first time. The influence of the urine matrix on the separation and the repeatability was evaluated with benzodiazepines as model substances in human urine. The applicability of 2D UTLC–AP–MALDI–MS was demonstrated in the detection of metabolites in an authentic urine sample.

Uusia lääkeaineita on perinteisesti etsitty luonnosta mutta luonnosta saatavien yhdisteiden kirjo ei ole kuitenkaan kyennyt kattamaan nykypäivän lääkkeenkehityksen tarvetta. Haasteena on saada markkinoille uusia yhdisteitä jo myynnissä olevien lääkeaineiden rinnalle. Tavoitteena on syntetisoida uusia yhdisteitä lääkeainekandidaateiksi mahdollisimman tehokkaasti. Näiden uusien yhdisteiden biologinen aktiivisuus ja ADME-ominaisuudet (lääkeaineen imeytyminen, jakautuminen, metabolia, ja eritys) testataan elimistön ulkopuolella jo paljon ennen ihmisillä tehtäviä kliinisiä kokeita, jotta lääkkeiksi kelvottomat yhdisteet voidaan seuloa pois mahdollisimman varhaisessa vaiheessa. Uusien yhdisteiden tuottamisessa käytettävät synteesimenetelmät ovat tehokkaita ja nopeita, ja siksi myös uusien yhdistekirjastojen testausmenetelmien on oltava nopeita laadun varmistamiseksi. Nopeat, yksinkertaiset, taloudelliset ja herkät testausmenetelmät mahdollistavat laajojen yhdistekirjastojen nopean ja tehokkaan puhtausseulonnan ja luovat pohjan kirjastojen optimaaliseen laadunvalvontaan. Tällöin varhais-ADME–tutkimuksissa ja biologisen aktiivisuuden seulonnassa vältytään vääriltä positiivisilta tai negatiivisilta tuloksilta.

Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin ohutkerroskromatografian ja ultravioletti ja massaspektrometristen havainnointimenetelmien soveltuvuutta oikeellisuus- ja puhtaustutkimukseen. Työssä analysoitiin jo markkinoilla olevia lääkeaineita, synteesikirjaston yhdisteitä (lääkeainekandidaatteja) ja biologisia näytteitä. Yhdisteiden puhdistamisessa käytettiin preparatiivista tasokromatografiaa (PLC) ja laadunvarmistukseen liittyvissä tutkimuksissa korkean erotuskyvyn ohutkerroskromatografiaa (HPTLC) ja ultraohutkerroskromatografiaa (UTLC). Ohutkerroskromatografisilla menetelmillä saatuja tuloksia verrattiin myös nestekromatografialla saatuhin tuloksiin, koska nestekromatografia on valtamenetelmä nykypäivän laadunvarmistustesteissä. Massaspektrometrisista menetelmistä käytettiin matriisiavusteista laserdesorptio/ionisaatiomassaspektrometriaa (MALDI), ja sähkösumutus- (ESI) ja desorptiosähkösumutusionisaatio (DESI) massaspektrometriaa.

Työn tuloksena kehitettiin käyttökelpoisia, nopeita ja tehokkaita menetelmiä pienten lääkeaine- ja lääkeainekandidaattimolekyylien laadulliseen ja määrälliseen tutkimiseen.