Characterization of genomic diversity in extraintestinal pathogenic Escherichia coli (ExPEC) and development of a diagnostic DNA microarray for the differentiation of ExPEC isolates causing urinary tract infections

Abstract

Extraintestinal pathogenic Escherichia coli (ExPEC) represent a diverse group of strains of E. coli, which infect extraintestinal sites, such as the urinary tract, the bloodstream, the meninges, the peritoneal cavity, and the lungs. Urinary tract infections (UTIs) caused by uropathogenic E. coli (UPEC), the major subgroup of ExPEC, are among the most prevalent microbial diseases world wide and a substantial burden for public health care systems. UTIs are responsible for serious morbidity and mortality in the elderly, in young children, and in immune-compromised and hospitalized patients.

ExPEC strains are different, both from genetic and clinical perspectives, from commensal E. coli strains belonging to the normal intestinal flora and from intestinal pathogenic E. coli strains causing diarrhea. ExPEC strains are characterized by a broad range of alternate virulence factors, such as adhesins, toxins, and iron accumulation systems. Unlike diarrheagenic E. coli, whose distinctive virulence determinants evoke characteristic diarrheagenic symptoms and signs, ExPEC strains are exceedingly heterogeneous and are known to possess no specific virulence factors or a set of factors, which are obligatory for the infection of a certain extraintestinal site (e. g. the urinary tract).

The ExPEC genomes are highly diverse mosaic structures in permanent flux. These strains have obtained a significant amount of DNA (predictably up to 25% of the genomes) through acquisition of foreign DNA from diverse related or non-related donor species by lateral transfer of mobile genetic elements, including pathogenicity islands (PAIs), plasmids, phages, transposons, and insertion elements. The ability of ExPEC strains to cause disease is mainly derived from this horizontally acquired gene pool; the extragenous DNA facilitates rapid adaptation of the pathogen to changing conditions and hence the extent of the spectrum of sites that can be infected. However, neither the amount of unique DNA in different ExPEC strains (or UPEC strains) nor the mechanisms lying behind the observed genomic mobility are known.

Due to this extreme heterogeneity of the UPEC and ExPEC populations in general, the routine surveillance of ExPEC is exceedingly difficult. In this project, we presented a novel virulence gene algorithm (VGA) for the estimation of the extraintestinal virulence potential (VP, pathogenicity risk) of clinically relevant ExPECs and fecal E. coli isolates. The VGA was based on a DNA microarray specific for the ExPEC phenotype (ExPEC pathoarray). This array contained 77 DNA probes homologous with known (e.g. adhesion factors, iron accumulation systems, and toxins) and putative (e.g. genes predictably involved in adhesion, iron uptake, or in metabolic functions) ExPEC virulence determinants. In total, 25 of DNA probes homologous with known virulence factors and 36 of DNA probes representing putative extraintestinal virulence determinants were found at significantly higher frequency in virulent ExPEC isolates than in commensal E. coli strains. We showed that the ExPEC pathoarray and the VGA could be readily used for the differentiation of highly virulent ExPECs both from less virulent ExPEC clones and from commensal E. coli strains as well.

Implementing the VGA in a group of unknown ExPECs (n=53) and fecal E. coli isolates (n=37), 83% of strains were correctly identified as extraintestinal virulent or commensal E. coli. Conversely, 15% of clinical ExPECs and 19% of fecal E. coli strains failed to raster into their respective pathogenic and non-pathogenic groups. Clinical data and virulence gene profiles of these strains warranted the estimated VPs; UPEC strains with atypically low risk-ratios were largely isolated from patients with certain medical history, including diabetes mellitus or catheterization, or from elderly patients. In addition, fecal E. coli strains with VPs characteristic for ExPEC were shown to represent the diagnostically important fraction of resident strains of the gut flora with a high potential of causing extraintestinal infections.

Interestingly, a large fraction of DNA probes associated with the ExPEC phenotype corresponded to novel DNA sequences without any known function in UTIs and thus represented new genetic markers for the extraintestinal virulence. These DNA probes included unknown DNA sequences originating from the genomic subtractions of four clinical ExPEC isolates as well as from five novel cosmid sequences identified in the UPEC strains HE300 and JS299. The characterized cosmid sequences (pJS332, pJS448, pJS666, pJS700, and pJS706) revealed complex modular DNA structures with known and unknown DNA fragments arranged in a puzzle-like manner and integrated into the common E. coli genomic backbone. Furthermore, cosmid pJS332 of the UPEC strain HE300, which carried a chromosomal virulence gene cluster (iroBCDEN) encoding the salmochelin siderophore system, was shown to be part of a transmissible plasmid of Salmonella enterica.

Taken together, the results of this project pointed towards the assumptions that first, (i) homologous recombination, even within coding genes, contributes to the observed mosaicism of ExPEC genomes and secondly, (ii) besides en block transfer of large DNA regions (e.g. chromosomal PAIs) also rearrangements of small DNA modules provide a means of genomic plasticity. The data presented in this project supplemented previous whole genome sequencing projects of E. coli and indicated that each E. coli genome displays a unique assemblage of individual mosaic structures, which enable these strains to successfully colonize and infect different anatomical sites.

Escherichia coli-bakteerit kuuluvat ihmisen suoliston normaaliflooraan. Kuitenkin jotkut E. coli-kannat aiheuttavat tulehduksia ruuansulatuselimistössä (ns. enteric pathogenic E. coli) tai ruoansulatuselimistön ulkopuolella (ns. extraintestinal pathogenic E. coli [ExPEC]), kuten esimerkiksi virtsateissä, verenkierrossa, aivokalvoissa, vatsakalvoissa tai keuhkoissa. Virtsatietulehduksia aiheuttavat E. coli-kannat (ns. uropathogenic E. coli [UPEC]) muodostavat suurimman ExPEC-alaryhmän. UPEC:ien aiheuttamat virtsatietulehdukset kuuluvat yleisimpiin bakteeri-tulehduksiin maailmanlaajuisesti. Nämä tulehdukset kuormittavat huomattavasti yleistä terveydenhuoltoa, ja sen lisäksi aiheuttavat vakavia sairauksia ja kuolleisuutta riskiryhmissä, kuten vanhuksissa, nuorissa lapsissa, raskaana olevissa naisissa ja henkilöissä, joilla on huono vastustuskyky esimerkiksi diabeteksen takia.

ExPEC-kannat eroavat geneettisesti ja kliinisesti suoliston normaaliflooran ja ruoansulatuselimistön tulehduksia aiheuttavista E. coli-kannoista. Nämä kannat tuottavat monia erilaisia virulenssitekijöitä (eli tekijöitä, jotka antavat kannalle kyvyn aiheuttaa tartuntoja), joihin kuuluu muun muassa erilaisia myrkkyjä ja ympäristön raudan sitomiseen tarvittavia systeemejä, sekä elimiä, jotka mahdollistavat bakteerien kiinnittymisen erilaisiin pintoihin ja kehon soluihin. Kuitenkaan mikään näistä virulenssitekijöistä ei löydy kaikista ExPEC-kannoista, eikä myöskään yksin mahdollista bakteerin taudinaiheutuskykyä.

ExPEC-kantojen genomit ovat mosaiikkimaisia. Nämä bakteerit ovat saaneet arviolta neljäsosan DNA:staan toisilta bakteereilta erilaisten ”liikkuvien geneettisten elementtien” (mm. patogeenisyys-saarekkeet, plasmidit, faagit, ja transposonit) välityksellä. Tämä ”genomin ulkopuolinen” DNA-osa on suurimmalta osalta vastuussa ExPEC:ien taudinaiheutuskyvystä – se mahdollistaa kannan nopean sopeutumisen muuttuviin ympäristöihin (esimerkiksi suolistoon ja virtsateihin). Ei kuitenkaan ole tiedossa, kuinka suuri osa ExPEC- tai UPEC-genomeista koostuu vieraasta DNA:sta, eikä myöskään tiedetä, mitkä geneettiset mekanismit osallistuvat tähän ”perimän liikkuvuuteen”.

Tämä tutkimus auttoi osaltaan selvittämään ExPEC-genomien rakennetta ja rakentumismekanismeja. Viisi tähän asti tuntematonta ExPEC:ien DNA-sekvenssiä, jotka eristettiin tutkimuksen aikana, olivat rakentuneet kuten palapeli, jonka yksittäiset palat ovat peräisin eri palapeleistä. On hyvin todennäköistä, että jokaisen ExPEC-kannan genomi on ainutkertainen kokonaisuus. Mielenkiintoista oli myös se, että yksi tutkituista DNA-sekvensseistä oli osa plasmidia (eli liikkuvaa geneettistä elementtiä), joka tähän asti on tunnettu vain E. coli:n lähisukuisista Salmonella-bakteereista, jotka yleensä aiheuttavat suolistotulehduksia ihmisissä. Voi olla mahdollista, että ExPEC-kannat ja Salmonellat vaihtavat geneettistä materiaalia (esimerkiksi virulenssitekijöitä) myös luonnollisissa ympäristöissä, kuten esimerkiksi suolistossa.

Koska ExPEC- ja UPEC-kannat ovat erittäin heterogeenisiä, eli niillä on lukuisia erilaisia virulenssitekijöitä, niiden aiheuttamien tautien rutiininomainen tarkkailu ja diagnostisointi on hyvin vaikeaa. Tässä projektissa kehitettiin uudenlainen virulenssitekijä-algoritmi (ns. virulence gene algorithm), jonka avulla erilaisten ExPEC-kantojen taudinaiheutuskykyä (ns. pathogenicity risk) voidaan arvioida. Virulenssitekijä-algoritmi perustui DNA-mikrosiruun, joka sisälsi 77 DNA-sondia, jotka edustivat sekä tunnettuja, että myöskin otaksuttuja ExPEC-virulessitekijöitä. Mikrosirua arvioitiin vertaamalla suoliston normaaliflooran E. coli -kantoja virtsatietulehduksen aiheuttavien kantojen kanssa. 61 DNA-sondia (25 tunnettua ja 36 tähän asti tuntematonta virulenssitekijää) tavattiin suurimmalta osalta vain virtsatietulehduskannoissa. Tämä tutkimus osoitti, että suurella mahdollisuudella tautia aiheuttavat ExPEC-kannat on mahdollista erottaa sekä suoliston normaaliflooran kannoista, että vähemmän vaarallisista ExPEC-kannoista. Mielenkiintoista oli myös se, että 15% virtsateistä eristetyistä ExPEC-kannoista ja 19% normaaliflooran kannoista luokittuivat väärin (vastaavasti normaaliflooraa ja ExPEC:ja). Koska normaaliflooran-kaltaiset ExPEC-kannat olivat pääosin eristetty henkilöistä, jotka kuuluivat virtsatietulehdusten riskiryhmään (esim. diabetes- potilaista tai katetroiduista vanhuksista), tämä tutkimus osoitti, että ExPEC-kantojen mahdollisuus aiheuttaa virtsatietulehduksia on osaksi riippuvainen henkilön vastustuskyvystä. Tutkimus osoitti myös, että vaaralliset ExPEC-kannat voivat kuulua normaaliin suolistoflooraan. Tämä huomio korotti rutiininomaisen tarkkailun tärkeyttä riskiryhmissä ja osoitti, että mikrosiruja voidaan käyttää tehokkaaseen tautia aiheuttavien kantojen seulontaan.