Amplified fragment length polymorphism analysis in strain typing and identification of Listeria and Clostridium species

Abstract

DNA-pohjaiset genotyypitysmenetelmät ovat nykyään tärkeitä työkaluja bakteerien tunnistamisessa ja sukulaisuussuhteiden selvittämisessä. Eri genotyypitysmenetelmien soveltuvuudessa eri bakteerilajeille sekä erilaisiin tutkimustarkoituksiin on kuitenkin eroja. Tässä väitöstutkimuksessa selvitettiin amplified fragment length polymorphism (AFLP) –menetelmän soveltuvuutta elintarvikevälitteisten tautia-aiheuttavien bakteerien Listeria monocytogeneksen, Clostridium botulinumin ja Clostridium perfringensin geneettiseen tyypittämiseen.

Väitöstutkimuksessa kehitettiin AFLP-menetelmästä hyvin erotteleva sovellutus L. monocytogenes, C. botulinum ja C. perfringens kantojen karakterisointiin. Menetelmän todettiin olevan hyvin toistettava, nopea sekä helppokäyttöinen. Tutkimuksessa todettiin myös, että AFLP-menetelmää voidaan käyttää apuna eri listeria- ja klostridi-lajien tunnistamisessa. Menetelmästä on hyötyä etenkin klostridi-lajien diagnostiikassa, sillä nykyisin käytössä olevat diagnostiset menetelmät ovat osin puutteellisia. Kehitetyn AFLP sovellutuksen avulla luodut AFLP-tyypitystulokset voidaan kerätä tietokantoihin, joita voidaan hyödyntää mm. epidemiologisissa tutkimuksissa, elintarviketeollisuuden kontaminaatioreittien selvittämisessä, ruokamyrkytysepidemia selvityksissä sekä listeria- ja klostridi-lajien tunnistamisessa.

Väitöstyössä tutkittiin AFLP-menetelmän avulla L. monocytogeneksen kontaminaatioreittejä eineksiä valmistavassa elintarvikelaitoksessa kahdeksan vuoden aikana. Siivousrutiinien, valmistettavan tuotteen ja osastoinnin todettiin vaikuttavan tuotantoympäristön kontaminaatiotilanteeseen kuumennettuja eineksiä valmistavilla osastoilla. Osastolla, jolla valmistettiin eineksiä, joiden valmistusprosessiin ei kuulu kuumennuskäsittelyä, raaka-aineiden todettiin saastuttavan valmiita tuotteita. Siten raaka-aineiden laatuun tulisi kiinnittää erityistä huomiota kun valmistetaan eineksiä, joita ei kuumennuskäsitellä. Lisäksi tutkimuksessa osoitettiin, että tuotantolinjan rakenteelliset muutokset voivat edesauttaa elintarvikelaitosta pääsemään eroon listeriakontaminaatiosta.

Tutkimuksessa selvitettiin myös elintarvikkeiden tuotantoympäristössä pitkäkestoisen (persistoivan) kontaminaation aiheuttavien sekä satunnaisesti (sporadisesti) esiintyvien L. monocytogenes –kantojen välisiä eroja AFLP- ja pulssikenttäelektroforeesi-menetelmillä. Vaikka persistoivien kantojen todettiin eroavan sporadisista kannoista, ei persistoivilla kannoilla todettu olevan yhteistä geneettistä alkuperää.

In epidemiological studies, techniques that effectively discriminate between individual bacterial strains are essential. Recent developments in molecular techniques necessitate an ongoing need to tailor new genotyping methods for optimal characterization of different bacterial species and to evaluate their performance and suitability for research purposes.

In this thesis amplified fragment length polymorphism (AFLP) analysis was tailored for optimal characterization of Listeria monocytogenes and Clostridium botulinum. The suitability of the developed AFLP protocol to type L. monocytogenes, C. botulinum and Clostridium perfringens at strain level was evaluated. AFLP proved to be a highly reproducible, easy-to-use, relatively fast and highly discriminative approach. When AFLP was applied to L. monocytogenes strains, its discriminatory power was shown to equal that of PFGE, which is considered the current gold standard for molecular fingerprinting of L. monocytogenes. These features make AFLP analysis a useful alternative to other genotyping methods in, for example, outbreak investigations and contamination route studies.

Since phenotypic identification of Clostridium isolates is laborious, the suitability of AFLP for genomic species identification was assessed. The AFLP technique was applied to 129 strains representing 24 different Clostridium species. AFLP differentiated all species tested, except for Clostridium ramosum and Clostridium limosum. AFLP also differentiated between six different Listeria species. If AFLP profiles of well-defined strains are collected in identification libraries, the database can be a valuable additional tool for identification of Clostridium and Listeria species. Due to high throughput of samples, AFLP proved to be especially suitable for screening large numbers of isolates.

AFLP was also used to trace contamination routes of L. monocytogenes in a chilled food processing plant producing ready-to-eat and ready-to-reheat meals during an 8-year period. Cleaning routines, product type and degree of compartmentalization seemed to have an influence on the contamination status in compartments that produced cooked meals. In addition, raw materials were shown to cause contamination of uncooked meals. Thus, special attention should be paid to quality control of raw ingredients when uncooked ready-to-eat meals are produced. This work also demonstrated that structural adjustments of a production line may facilitate the eradication of L. monocytogenes from the food processing environment.

AFLP and PFGE analysis of sporadic L. monocytogenes strains and strains that cause persistent plant contamination revealed that persistent strains differ from sporadic strains. However, no specific evolutionary lineage of persistent strains was observed.