Use of non-specific and specific interactions in the analysis of testosterone and related compounds by capillary electromigration techniques

Abstract

Determination of testosterone and related compounds in body fluids is of utmost importance in doping control and the diagnosis of many diseases. Capillary electromigration techniques are a relatively new approach for steroid research. Owing to their electrical neutrality, however, separation of steroids by capillary electromigration techniques requires the use of charged electrolyte additives that interact with the steroids either specifically or non-specifically. The analysis of testosterone and related steroids by non-specific micellar electrokinetic chromatography (MEKC) was investigated in this study. The partial filling (PF) technique was employed, being suitable for detection by both ultraviolet spectrophotometry (UV) and electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS). Efficient, quantitative PF-MEKC–UV methods for steroid standards were developed through the use of optimized pseudostationary phases comprising surfactants and cyclodextrins. PF-MEKC–UV proved to be a more sensitive, efficient and repeatable method for the steroids than PF-MEKC–ESI-MS. It was discovered that in PF-MEKC analyses of electrically neutral steroids, ESI-MS interfacing sets significant limitations not only on the chemistry affecting the ionization and detection processes, but also on the separation. The new PF-MEKC–UV method was successfully employed in the determination of testosterone in male urine samples after microscale immunoaffinity solid-phase extraction (IA-SPE). The IA-SPE method, relying on specific interactions between testosterone and a recombinant anti-testosterone Fab fragment, is the first such method described for testosterone. Finally, new data for interactions between steroids and human and bovine serum albumins were obtained through the use of affinity capillary electrophoresis. A new algorithm for the calculation of association constants between proteins and neutral ligands is introduced.

Testosteronin ja sen sukuisten steroidien määrittäminen kehon nesteistä on keskeistä monien sairauksien diagnosoinnissa sekä doping-valvonnassa. Perinteiset steroidien analyysimenetelmät kärsivät usein joko riittämättömästä spesifisyydestä tai työläästä näytteiden esikäsittelystä.

Tässä työssä tutkittiin testosteronin ja sen sukuisten steroidien määrittämistä kapillaarielektromigraatiotekniikoilla. Kyseiset tekniikat ovat varsin uusi lähtökohta steroiditutkimuksille. Kapillaarielektromigraatiotekniikat perustuvat molekyylien erottamiseen toisistaan voimakkaassa sähkökentässä. Nestemäinen näyte syötetään ohueen kapillaariin, jonka halkaisija on tyypillisesti 20–100 mikrometriä. Kapillaari on ennen näytteensyöttöä täytetty elektrolyyttinesteellä, ja näytteensyötön jälkeen sen molemmat päät asetetaan elektrolyyttiastioihin yhdessä elektrodien kanssa. Erotuksen aikaansaamiseksi elektrodien välille kytketään voimakas sähkökenttä. Sähköisesti varautuneet molekyylit (ionit) erottuvat sähkökentässä niiden erilaisten elektroforeettisten liikkuvuuksien mukaisesti.

Steroidien sähköisestä varauksettomuudesta johtuen niillä ei ole elektroforeettista liikkuvuutta sähkökentässä. Kapillaarielektromigraatiotekniikoiden soveltaminen steroidien erottamiseen edellyttääkin ionisoituvien orgaanisten lisäaineiden käyttöä elektrolyyttiliuoksessa. Lisäaineilla voi olla joko spesifisiä tai epäspesifisia vuorovaikutuksia steroidien kanssa.

Tässä työssä testosteronin ja sen sukuisten steroidien määrittämistä tutkittiin epäspesifisellä misellisellä sähkökineettisellä kromatografialla (MEKC). Elektrolyyttiliuoksessa käytettiin lisäaineina tensidejä sekä syklodekstriinejä. Kapillaari täytettiin vain osittain misellisellä elektrolyyttiliuoksella, minkä ansiosta steroidit voitiin tunnistaa sekä ultraviolettispektrofotometrisesti (UV) että sähkösumutus-ionisaatiomassaspektrofotometrisesti (ESI-MS). Osittaistäyttöön (PF) perustuva PF-MEKC–UV osoittautui herkemmäksi, tehokkaammaksi ja toistettavammaksi menetelmäksi kuin PF-MEKC–ESI-MS. Tutkimuksessa havaittiin, että ESI-MS-liitäntä asettaa huomattavia kemiallisia rajoituksia paitsi ionisaatio- ja detektointitapahtumille myös erotustapahtumalle.

Uusilla PF-MEKC–UV-menetelmillä steroidistandardit voidaan analysoida nopeasti, tehokkaasti ja kvantitatiivisesti. Herkin PF-MEKC–UV-menetelmä soveltuu testosteronin nopeaan ja spesifiseen määrittämiseen miesten virtsanäytteistä miniatyrisoidun immunoaffiniteettikiinteäfaasiuuton (IA-SPE) jälkeen. Tutkimuksessa kehitetty IA-SPE perustuu vuorovaikutuksiin testosteronin ja sille spesifisen rekombinantin Fab-vasta-ainefragmentin välillä. IA-SPE on yksinkertainen ja nopea näytteen esikäsittelymenetelmä, jonka avulla tutkittava yhdiste voidaan konsentroida ja eristää muista näytemolekyyleistä. IA-SPE:tä ei ole aikaisemmin sovellettu testosteronin eristämiseen.

Uutta tietoa steroidien sekä ihmisen ja naudan seerumin albumiiniproteiinien välisistä vuorovaikutuksista saatiin affiniteettikapillaarielektroforeesin avulla. Tutkimuksessa kehitettiin uusi algoritmi, jonka avulla voidaan laskea proteiinien ja neutraalien ligandien välisiä sitoutumisvakioita. Testosteronin ja sen sukuisten steroidien sitoutumisessa albumiiniproteiineihin havaittiin merkittäviä eroja.