Palladin, a novel microfilament protein

Abstract

Palladin is a novel actin microfilament associated protein, which together with myotilin and myopalladin forms a novel cytoskeletal IgC2 domain protein family. Whereas the expression of myotilin and myopalladin is limited mainly to striated muscle, palladin is widely expressed in both epithelial and mesenchymal tissues, including heart and the nervous system. Palladin has a complex genetic structure and it is expressed as several different sized and structured splice variants, which also display differences in their expression pattern and interactions. In muscle cells, all the family members localize to the sarcomeric Z-disc, and in non-muscle cells palladin also localizes to the stress-fiber-dense regions, lamellipodia, podosomes and focal adhesions. A common feature of this protein family is the binding to α-actinin, but other interactions are mostly unique to each member. Palladin has been shown to interact with several proteins, including VASP, profilin, Eps8, LASP-1 and LPP. Its domain structure, lack of enzymatic activity and multiple interactions define it as a molecular scaffolding protein, which links together proteins with different functional modalities into large complexes. Palladin has an important role in cytoskeletal regulation, particularly in stress fiber formation and stabilization. This assumption is supported by several experimental results. First, over-expression of palladin in non-muscle cells results in rapid reorganization of the actin cytoskeleton and formation of thick actin bundles. Second, the knock-down of palladin with anti-sense and siRNA techniques or knock-out by genetic methods leads to defective stress fiber formation. Furthermore, palladin is usually up-regulated in situations requiring a highly organized cytoskeleton, such as differentiation of dendritic cells, trophoblasts and myofibroblasts, and activation of astrocytes during glial scar formation. The protein family members have also direct disease linkages; myotilin missense mutations are the cause of LGMD1A and myofibrillar myopathy. Palladin mutations and polymorphisms, on the other hand, have been linked to hereditary pancreatic cancer and myocardial infarction, respectively. In this study we set out to characterize human palladin. We identified several palladin isoforms, studied their tissue distribution and sub-cellular localization. Four novel interaction partners were identified; ezrin, ArgBP2, SPIN90 and Src-kinase.The previously identified interaction between palladin and α-actinin was also characterized in detail. All the identified new binding partners are actin cytoskeleton associated proteins; ezrin links the plasma membrane to the cytoskeleton, ArgBP2 and SPIN90 localize, among other structures, to the lamellipodia and in cardiomyocytes to the Z-disc. Src is a transforming tyrosine kinase, which besides its role in oncogenesis has also important cytoskeletal associations. We also studied palladin in myofibroblasts, which are specialized cells involved in diverse physiological and pathological processes, such as wound healing and tissue fibrosis. We demonstrated that palladin is up-regulated during the differentiation of myofibroblasts in an isoform specific manner, and that this up-regulation is induced by TGF-β via activation of both the SMAD and MAPK signalling cascades. In summary, the results presented here describe the initial characterization of human palladin and offer a basis for further studies.

Palladin on hiljattain tunnistettu aktiini tukirangan proteiini, joka yhdessä myotilinin ja myopalladinin kanssa muodostaa uuden proteiiniperheen. Yhteinen piirre perheen jäsenille on rakenteellinen yksikkö, IgC2 domeeni, näitä domeeneja on myotilinissa kaksi, myopalladinissa viisi ja palladinissa kolmesta viiteen. Myotilinia ja myopalladinia ilmennetään pääasiassa poikkijuovaisessa lihaksessa, palladinin ilmentyminen sen sijaan on laajaa käsittäen sekä epiteliaaliset että mesenkymaaliset kudokset, sydänlihaksen ja keskushermoston. Palladinin geneettinen rakenne on monimutkainen ja sitä ilmennetäänkin useana toisistaan sekä kooltaan että rakenteeltaan poikkeavana isoformina. Isoformit eroavat toisistaan lisäksi kudosilmentymisen ja sitoutumiskumppaniensa osalta. Lihassoluissa kaikki proteiiniperheen jäsenet lokalisoituvat sarkomeeriin, tarkemmin ns. Z-juovaan. Muissa solutyypeissä, joissa palladinia ilmennetään se lokalisoituu aktiinista muodostuviin stressisäikeisiin, lamellipodioihin, podosomeihin ja fokaali adheesioihin. Rakenteellisen samankaltaisuuden ohella proteiiniperheen jäsenille on yhteistä myös sitoutuminen tärkeään aktiinitukirangan proteiiniin, α-aktiniiniin, muuten jokaisella jäsenellä on pääasiassa omat sitoutumiskumppaninsa. Palladinilla toistaiseksi tunnettuja kumppaneita ovat mm. ezriini, VASP, profiliini, Eps8, LASP-1 ja LPP. Palladin toimii soluissa todennäköisesti ns. linkkeriproteiinina, joka sitoutumalla samanaikaisesti useaan proteiiniin saattaa nämä yhteen suuremmiksi komplekseiksi. Kyseistä tulkintaa palladinin roolista tukevat mm. sen molekyläärinen rakenne ja entsymaattisen aktiivisuuden puuttuminen. Palladinin solunsisäinen sijoittuminen ja useat koetulokset viittavat siihen että sen pääasiallinen funktio liittyy aktiinitukirangan järjestäytymiseen ja sen ylläpitoon, erityisesti stressisäikeiden osalta. Palladinin kokeellisesti aikaansaatu normaalia runsaampi ilmentyminen soluissa saa aikaan nopean aktiinitukirangan uudelleen järjestäytymisen johon liittyy paksujen aktiinikimppujen muodostuminen. Vastavuoroisesti palladinin ilmentymisen esto ns. anti-sense ja siRNA tekniikoilla johtaa stressisäikeiden hajoamiseen, tämä on osoitettu myös palladinin suhteen poistogeenisen hiiren soluilla tehdyissä kokeissa. Palladinin ilmentyminen lisääntyy tilanteissa, joissa solujen täytyy uudelleen organisoida tukirankansa kuten esimerkiksi trofoblastien, myofibroblastien ja dendriittisten solujen erilaistuessa ja astrosyyttien aktivoituessa glioosissa. Proteiiniperheen jäsenillä on myös suoria tautiyhteyksiä: myotilin geenin mutaatiot aiheuttavat perinnöllisiä lihastauteja: LGMD1A ja MFM ; kun taas tietyn palladinin mutaation on osoitettu liittyvän perinnölliseen haimasyöpään ja polymorfian lisääntyneeseen sydäninfarktin riskiin. Nykyisessä tutkimuksessamme pyrimme selvittämään ihmisen palladinin toimintaa. Tunnistimme useita proteiini isoformeja ja tutkimme niiden ilmentymistä kudoksissa ja soluissa. Kuvasimme neljä uutta sitoutumiskumppania: ezriinin,ArgBP2:n, SPIN90:n ja Src-kinaasin; myös aiemmin tunnistettu sitoutuminen α-aktiniiniin selvitettiin yksityiskohtaisesti. Kaikki uudet sitoutumiskumppanit ovat aktiinitukirankaan liittyviä proteiineja: ezriini liittää solukalvon ja tukirangan yhteen; ArgBP2 ja SPIN90 lokalisoituvat mm. sydänlihassoluissa Z-juovaan kuten palladinkin. Src on tyrosiinikinaasi, jonka hallitsematon aktiivisuus johtaa solujen muuntumiseen pahanlaatuisiksi l. maligniin transformaatioon. Src:lla on myös monenlaisia vaikutuksia aktiini tukirankaan ja se säätelee monien tukiranka proteiinien toimintaa fosforylaation kautta. Tutkimme palladinin toimintaa myös myofibroblasteissa. Nämä fibroblasteista kehittyvät erilaistuneet solut ovat tärkeässä roolissa monissa fysiologisissa ja patologisissa prosesseissa mm. haavan parantumisessa ja kudosfibroosin kehittymisessä. Osoitimme että palladinin määrä lisääntyy erilaistumisprosessin aikana siten että myofibroblastit alkavat ilmentää kookkaampaa palladin isoformia, jota ei tavallisissa fibroblasteissa tavata. Tämän ilmentymisen lisääntymisen saa aikaan kasvutekijä TGF-β, jonka vaikutukset välittyvät SMAD ja MAPK signalointireittien kautta. Soluviljelmillä tehtyjen kokeiden tulokset varmennettiin sekä ihmisen kudosnäytteissä että rotan kokeellisessa haavamallissa. Kuvatut tulokset selvittävät ihmisen palladin proteiinin tehtävää ja muodostavat täten pohjan jatkotutkimuksille.