HPLC analysis of plant sterol oxidation products

Abstract

Increased interest in the cholesterol-lowering effect of plant sterols has led to development of plant sterol-enriched foods. When products are enriched, the safety of the added components must be evaluated. In the case of plant sterols, oxidation is the reaction of main concern. In vitro studies have indicated that cholesterol oxides may have harmful effects. Due their structural similarity, plant sterol oxidation products may have similar health implications.

This study concentrated on developing high-performance liquid chromatography (HPLC) methods that enable the investigation of formation of both primary and secondary oxidation products and thus can be used for oxidation mechanism studies of plant sterols. The applicability of the methods for following the oxidation reactions of plant sterols was evaluated by using oxidized stigmasterol and sterol mixture as model samples.

An HPLC method with ultraviolet and fluorescence detection (HPLC-UV-FL) was developed. It allowed the specific detection of hydroperoxides with FL detection after post-column reagent addition. The formation of primary and secondary oxidation products and amount of unoxidized sterol could be followed by using UV detection. With the HPLC-UV-FL method, separation between oxides was essential and oxides of only one plant sterol could be quantified in one run. Quantification with UV can lead to inaccuracy of the results since the number of double bonds had effect on the UV absorbance.

In the case of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), separation of oxides with different functionalities was important because some oxides of the same sterol have similar molecular weight and moreover epimers have similar fragmentation behaviour. On the other hand, coelution of different plant sterol oxides with the same functional group was acceptable since they differ in molecular weights. Results revealed that all studied plant sterols and cholesterol seem to have similar fragmentation behaviour, with only relative ion abundances being slightly different. The major advantage of MS detection coupled with LC separation is the capability to analyse totally or partly coeluting analytes if these have different molecular weights.

The HPLC-UV-FL and LC-MS methods were demonstrated to be suitable for studying the photo-oxidation and thermo-oxidation reactions of plant sterols. The HPLC-UV-FL method was able to show different formation rates of hydroperoxides during photo-oxidation. The method also confirmed that plant sterols have similar photo-oxidation behaviour to cholesterol. When thermo-oxidation of plant sterols was investigated by HPLC-UV-FL and LC-MS, the results revealed that the formation and decomposition of individual hydroperoxides and secondary oxidation products could be studied. The methods used revealed that all of the plant sterols had similar thermo-oxidation behaviour when compared with each other, and the predominant reactions and oxidation rates were temperature dependent. Overall, these findings showed that with these LC methods the oxidation mechanisms of plant sterols can be examined in detail, including the formation and degradation of individual hydroperoxides and secondary oxidation products, with less sample pretreatment and without derivatization.

Valmistettaessa terveysvaikutteisia elintarvikkeita täytyy lisätyn ainesosan kemiallinen pysyvyys taata. Kasvisteroleiden tapauksessa hapettuminen on suurin huolenaihe. Kolesterolin hapettumistuotteet on havaittu koeputkitutkimuksissa terveydelle haitallisiksi. Kasvisteroleiden rakenne on hyvin samankaltainen kuin kolesterolin rakenne, joten voidaan olettaa että kasvisteroleiden hapettumistuotteilla saattaa olla samankaltaisia terveysvaikutuksia. Jotta hapettumista voidaan estää ja kontrolloida, hapettumismekanismi täytyy tuntea. Hapettumismekanismin tutkiminen puolestaan edellyttää analyysitekniikoita, jotka mahdollistavat yksittäisten hapettumistuotteiden muodostumisen seurannan.

Aikaisemmin kasvisteroleiden hapettumistuotteita on analysoitu kaasukromatografisilla tekniikoilla, jotka edellyttävät korkeita lämpötiloja sekä paljon näytteen esikäsittelyä. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kehittää nestekromatografisia menetelmiä, jotka mahdollistaisivat kasvisteroleiden hapettumisketjun tutkimisen, mukaan lukien lämpöherkät ensimmäisen vaiheen hapettumistuotteet hydroperoksidit sekä toisen vaiheen hapettumistuotteet. Menetelmien toimivuutta arvioitiin käyttämällä malliaineina hapetettua stigmasterolia ja kasvisteroliseosta.

Aluksi kehitettiin nestekromatografinen menetelmä, jossa käytettiin ilmaisimina ultravioletti- ja fluoresenssi-ilmaisimia. Ultravioletti-ilmaisimella pystyttiin seuraamaan hapettumattoman sterolin ja hapettumistuotteiden muodostumista ja hajoamista. Fluoresenssi-ilmaisimella puolestaan voitiin analysoida ensimmäisen vaiheen hydroperoksisidit spesifisesti. Tämä menetelmä soveltuu erityisesti yksinkertaisille malleille, jotka sisältävät vain yhden kasvisterolin hapettumistuotteita.

Seuraavaksi kehitettiin nestekromatografia-massaspektrometriaan perustuva menetelmä. Menetelmän avulla hapettumistuotteiden analysointi kasvisteroliseoksista oli mahdollista. Menetelmän edellytyksenä oli, että päällekkäin eluoituvien yhdisteiden oli poikettava molekyylipainoltaan, minkä seurauksella eri funktionaalisuuden omaavat hapettumistuotteet oli eroteltava toisistaan nestekromatografiaa käyttäen.

Nämä nestekromatografiset menetelmät osoittautuivat soveltuvan hyvin kasvisteroleiden hapettumismekanismien yksityiskohtaiseen tutkimiseen. Menetelmien avulla voitiin osoittaa, että kolesteroli ja stigmasteroli käyttäytyivät samalla tavalla foto-oksidaation aikana. Lisäksi havaittiin, että pääkasvisteroleilla on samanlainen termo-oksidaatiokäyttäytyminen. Hallitsevat reaktiot ja hapettumisnopeudet osoittautuivat olevan lämpötilasta riippuvia. Nämä menetelmät olivat nopeita ja mahdollistivat myös lämpöherkkien tuotteiden analysoinnin. Menetelmät tarjoavat meille avaimet, joiden avulla hapettumisketjua ja siihen vaikuttavia tekijöitä voidaan tutkia. Näin saamme tietoa, kuinka elintarvikkeiden laatua heikentävää hapettumista voidaan kontrolloida ja estää.