Lantibiotic Nisin and Its Detection Methods

Abstract

The type A lantibiotic nisin produced by several Lactococcus lactis strains, and one Streptococcus uberis strainis a small antimicrobial peptide that inhibits the growth of a wide range of gram-positive bacteria, such as Bacillus, Clostridium, Listeria and Staphylococcus species. It is nontoxic to humans and used as a food preservative (E234) in more than 50 countries including the EU, the USA, and China. National legislations concerning maximum addition levels of nisin in different foods vary greatly. Therefore, there is a demand for non-laborious and sensitive methods to identify and quantify nisin reliably from different food matrices. The horizontal inhibition assay, based on the inhibitory effect of nisin to Micrococcus luteus is the base for most quantification methods developed so far. However, the sensitivity and accuracy of the agar diffusion method is affected by several parameters. Immunological tests have also been described. Taken into account the sensitivity of immunological methods to interfering substances within sample matrices, and possible cross-reactivities with lantibiotics structurally close to nisin, their usefulness for nisin detection from food samples remains limited.

The proteins responsible for nisin biosynthesis, and producer self-immunity are encoded by genes arranged into two inducible operons, nisA/Z/QBTCIPRK and nisFEG, which also contain internal, constitutive promoters PnisI and PnisR. The transmembrane histidine kinase NisK and the response regulator NisR form a two-component signal transduction system, in which NisK autophosphorylates after exposure to extra cellular nisin, and subsequently transfers the phosphate to NisR. The phosphorylated NisR then relays the signal downstream by binding to two regulated promoters in the nisin gene cluster, i.e the nisA/Z/Qand the nisF promoters, thus activating transcription of the structural gene nisA/Z/Q and the downstream genes nisBTCIPRK from the nisA/Z/Q promoter, and the genes nisFEG from the nisF promoter.

In this work two novel and highly sensitive nisin bioassays were developed. Both of these quantification methods were based on NisRK mediated, nisin induced Green Fluorescent Protein (GFP) fluorescence. The suitabilities of these assays for quantifica¬tion of nisin from food samples were evaluated in several food matrices. These bioassays had nisin sensitivities in the nanogram or picogram levels. In addition, shelf life of nisin in cooked sausages and retainment of the induction activity of nisin in intestinal chyme (intestinal content) was assessed.

Nisiini on eräiden Lactococcus lactis -maitohappobakteerikantojen tuottama antimikrobinen peptidi. Nisiini inhiboi useiden gram-positiivisten elintarvikepatogeenien, kuten Bacillus, Clostridium, Listeria ja Staphylococcus -sukujen kasvua. Nisiini on ihmisille vaaraton, ja siksi sitä käytetään elintarvikelisäaineena (E234) yli 50 maassa, mukaan lukien EU, USA ja Kiina. Nisiinin elintarvikekäyttöä koskevat lait ja säädökset vaihtelevat huomattavasti eri maissa. Tästä syystä on tarpeellista kehittää nisiinimittausmenetelmiä, jotka ovat sekä luotettavia, herkkiä, yksinkertaisia suorittaa, että nisiinispesifisiä. Yhä edelleen eniten käytetty nisiinin mittausmenetelmä, agardiffuusiomenetelmä, on epätarkka, antaa vääriä positiivisia tuloksia ja on työläs suorittaa.

Nisiinin synteesiin ja nisiinituottajan immuniteetin kehittämiseen osallistuvat geenit ovat järjestäytyneet kahdeksi nisiini-indusoituvaksi operoniksi, nisA/Z/QBTCIPRK ja nisFEG. Tämän työn kannalta keskeiset nisiinigeenit olivat nisRK: proteiinit NisRK muodostavat kaksikomponenttisen signaalivälitysjärjestelmän, jossa solukalvoassosioitunut histidiinikinaasi NisK fosforyloi NisR-proteiinin, kun solujen kasvuympäristössä on nisiiniä. Fosforyloitunut NisR puolestaan toimii transkriptioaktivaattorina, aktivoiden nisiinioperonien sisältämien nisiini-indusoituvien nisA/Z/Q ja nisFEG promoottorien säätelemien geenien ekspressiota.

Tässä työssä kehitettiin kaksi uutta ja erityisen herkkää nisiinin mittausmenetelmää. Molemmissa menetelmissä hyödynnetään NisRK signaalivälitysjärjestelmää siten, että solun ulkopuolinen nisiini aktivoi vihreän fluoresoivan proteiinin tuottoa. Menetelmien soveltuvuus nisiinin mittaamiseen elintarvikenäytteistä verifioitiin useissa elintarvikematriiseissa. Lisäksi kehitettyjen menetelmien avulla määritettiin nisiinin puoliintumisaika sekä keitetyissä makkaroissa että suolisto-oloissa.