Asymmetrical flow field-flow fractionation in the study of water-soluble macromolecules

Abstract

Asymmetrical flow field-flow fractionation (AsFlFFF) was constructed, and its applicability to industrial, biochemical, and pharmaceutical applications was studied. The effect of several parameters, such as pH, ionic strength, temperature and the reactants mixing ratios on the particle sizes, molar masses, and the formation of aggregates of macromolecules was determined by AsFlFFF. In the case of industrial application AsFlFFF proved to be a valuable tool in the characterization of the hydrodynamic particle sizes, molar masses and phase transition behavior of various poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) polymers as a function of viscosity and phase transition temperatures. The effect of sodium chloride salt and the molar ratio of cationic and anionic polyelectrolytes on the hydrodynamic particle sizes of poly (methacryloxyethyl trimethylammonium chloride) and poly (ethylene oxide)-block-poly (sodium methacrylate) and their complexes were studied. The particle sizes of PNIPAM polymers, and polyelectrolyte complexes measured by AsFlFFF were in agreement with those obtained by dynamic light scattering. The molar masses of PNIPAM polymers obtained by AsFlFFF and size exclusion chromatography agreed also well. In addition, AsFlFFF proved to be a practical technique in thermo responsive behavior studies of polymers at temperatures up to about 50 oC.

The suitability of AsFlFFF for biological, biomedical, and pharmaceutical applications was proved, upon studying the lipid-protein/peptide interactions, and the stability of liposomes at different temperatures. AsFlFFF was applied to the studies on the hydrophobic and electrostatic interactions between cytochrome c (a basic peripheral protein) and anionic lipid, and oleic acid, and sodium dodecyl sulphate surfactant. A miniaturized AsFlFFF constructed in this study was exploited in the elucidation of the effect of copper (II), pH, ionic strength, and vortexing on the particle sizes of low-density lipoproteins.

Väitöstyössä valmistettiin asymmetrinen virtauskenttävirtausfraktiointi(AsFlFFF)laitteisto ja tutkittiin sen soveltuvuutta teollisten, biokemiallisten ja farmaseuttisten näytteiden analysointiin. Laitteistolla tutkittiin useiden muuttujien kuten pH:n, ionivahvuuden, lämpötilan ja reaktanttien sekoitussuhteen vaikutusta tutkittavan näytteen hiukkaskokoon, moolimassaan sekä aggregaatioon. Teollisten näytteiden kohdalla AsFlFFF osoittautui tehokkaaksi työkaluksi poly(N-isopropyyliakryyliamidin) (PNIPAM) hydrodynaamisen hiukkaskoon, moolimassan sekä faasinmuutoskäyttäytymisen määrityksessä, kun ajoliuoksen viskositeettia ja lämpötilaa vaihdeltiin. Tutkittiin myös natriumkloridin sekä eri moolisuhteissa lisättyjen kationisten ja anionisten polyelektrolyyttien vaikutusta poly(metakryloetyylitrimetyyliammoniumkloridin) ja poly(natriummetakrylaatti) - poly(etyleenioksidi) -blokkikopolymeerin sekä näiden välisten kompleksien hydrodynaamiseen hiukkaskokoon. AsFlFFF:llä PNIPAM- polymeerinäytteille saadut hiukkaskoot eivät poikenneet vastaavista dynaamisella valonsironnalla saaduista tuloksista. Suuria eroja ei havaittu myöskään AsFlFFF:llä ja kokoekskluusiokromatografialla PNIPAM-näytteille määritetyissä moolimassoissa. AsFlFFF osoittautui käytännölliseksi tekniikaksi lämpöherkkien polymeerien tutkimuksessa toimittaessa alle 50 oC lämpötiloissa.

AsFlFFF:n käyttökelpoisuus biologisiin, biolääketieteellisiin ja farmaseuttisiin sovelluksiin osoitettiin tutkimalla lipidi-proteiini/peptidi vuorovaikutuksia ja liposomien stabiilisuutta eri lämpötiloissa. Menetelmällä tutkittiin anionisen lipidin, oleiinihapon sekä natriumdodekyylisulfaatin ja sytosomi-C:n välillä ilmeneviä hydrodynaamisia ja sähköstaattisia vuorovaikutuksia. Työn yhteydessä rakennettua miniatyrisoitua AsFlFFF-kanavaa käytettiin tutkittaessa kupari(II):n, ionivahvuuden sekä pyörresekoituksen (vortexing) alhaisen tiheyden lipoproteiinin (LDL) partikkelikokoon aiheuttamia muutoksia.